β-二氫青蒿素-大黃素復合物對人胃癌細胞株SGC-7901作用的實驗研究

辛 悅，楊萬山，金光洙，趙俊軍，孫 抒*

(1.大連市中心醫院 病理科，遼寧 大連116000；2.延邊大學醫學院 病理學與法醫學教研室，延吉133002；3.延邊大學藥學院藥物化學教研室，延吉133002)

胃癌(gastric carcinoma，GC),全球第四大常見癌癥之一，其發病率占消化道腫瘤之首，多數發現的臨床患者都已達到中晚期，這就面臨著單純手術療效差，輔以放、化療毒副作用大的問題[1-3]。為了減輕患者的痛苦，提高其生活質量，我們將視線轉投到從天然藥用資源中尋找高效低毒的化合物作為新一代的化療藥物的開發上。近些年的研究發現二氫青蒿素具有一定的抗腫瘤作用[4]。二氫青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)是青蒿素衍生物中主要的活性代謝體。分子式為C15H24O5，分子量為284，具有良好的吸收性。另外一種頗為受矚目的抗腫瘤中藥為大黃素，它是中醫治療腫瘤方劑中最常用的藥物之一。大黃素(emodin)，化學名為l,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌(1,3,8-trihydroxy-6-methylanthra-quinone)屬蒽醌類衍生物,是從植物Polygonum Cuspidatum中提取的，具有廣泛的藥理作用，既往的文獻指出，大黃素對肺癌[5]、宮頸癌[6]、乳腺癌[7]、結腸癌[8]、胃癌[9]、肝癌[10]等多種腫瘤細胞的增殖有明顯的抑制作用。本實驗使用的復合物是二氫青蒿素和大黃素通過酯鍵結合形成的的新型抗腫瘤候選化合物-β-二氫青蒿素-大黃素復合物。目前，β-二氫青蒿素-大黃素復合物抗腫瘤作用尚未見報道。本實驗選取人胃癌SGC-7901細胞株為實驗細胞，旨在研究β-二氫青蒿素-大黃素復合物能否誘導人胃癌SGC-7901細胞發生凋亡并探討其機制，為β-二氫青蒿素-大黃素復合物具有抗腫瘤作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株與藥物

人胃癌細胞SGC-7901購買于北京華美生科生物技術有限公司，由本實驗室體外培養、傳代。β-二氫青蒿素-大黃素復合物由延邊大學藥學院金光洙博士合成提供，先用吐溫80和0.3%的纖維素鈉溶解，并將其混勻，于-4℃保存備用。再根據需要，用PBS稀釋成實驗所需濃度。

1.2 主要試劑及儀器

MTT(Biomol公司)；蘇木素染液(Solarbio公司)；單克隆抗體(CyclinD1，Ki-67)、Annexin-V/PI試劑盒、(美國Becton Dikinson公司)；Hoechst33258熒光染色試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；十二烷基硫酸鈉(SDS)，N,N-亞甲雙丙烯酰胺，TEMED，丙烯酰胺，過硫酸銨(APS)，β-巰基乙醇，β-actin(美國sigma公司)；光學顯微鏡、熒光顯微鏡(日本OLYMPUS)；流式細胞儀(美國BD公司)；SDS-PAGE電泳儀(Bio-red美國公司)；全波長酶聯免疫檢測儀(TECAN公司產品，型號infiniteM200PRO)。

1.3 方法

1.3.1MTT比色法

按照MTT的實驗原則，將濃度為6×104個/ml的胃癌SGC-7901細胞懸液接種于96孔培養板中，實驗孔每孔加入180 μl的細胞懸液后，放入培養箱過夜。次日觀察貼壁后，每個實驗孔加入20 μl的藥物，藥物終濃度分別為2.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml，而對照組每孔則加入20 μl的藥物溶劑作為陰性對照。分別培養24 h、48 h、72 h后，加入20 μl的 MTT溶液(其濃度為5 mg/ml)，培養4 h后，取出，避光，每孔加入150 μl的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，放在震蕩儀上振蕩，最后酶聯免疫檢測儀檢測在波長為492 nm處的吸光度(Optical density，OD)值。

為了保證實驗的準確性，重復實驗3次。利用公式計算出細胞的增殖抑制率。計算公式如下：腫瘤細胞增殖抑制率(%)=(1-加藥組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3.2HE染色

將人胃癌SGC-7901細胞制成濃度為6×104個/ml的細胞懸液爬片培養。次日確定細胞生長狀態良好進行試驗。設定分別加入終濃度為2.5 μg/ml、5 μg/ml、7.5 μg/ml的β-二氫青蒿素-大黃素復合物的為實驗組，加等量藥物溶劑的為對照組，培養48 h后，取出蓋玻片，用95%乙醇室溫固定30 min。沖洗后，蘇木素染色3-5 min，1%鹽酸酒精分化1-3 s后，溫水返藍，伊紅染液30 s，梯度酒精脫水各1-2 min，之后二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.3.3Hoechst33258染色

人胃癌SGC-7901細胞進行爬片，確定爬片且細胞狀態良好則進行實驗。分別加入終濃度為2.5 μg/ml、5 μg/ml、7.5 μg/ml的β-二氫青蒿素-大黃素復合物作為實驗組，加入等量的藥物溶劑作為對照組，放入培養箱內培養48 h。48 h后準備固定和染色。用PBS洗滌后，各孔均加入0.5 ml的固定液，4℃過夜；次日洗滌后，加入0.5 ml的Hoechst33258染色液，避光染色5 min；去染色液，滴抗熒光淬滅封片液封片。熒光顯微鏡下可檢測到藍色的細胞核，激發波長在350 nm左右，發射波長在460 nm左右，拍照記錄。

1.3.4Annexin V/PI雙染

用冷PBS分別洗滌實驗組和對照組細胞2次，1 000 rpm，5 min；之后，加入500 μl的1×Binding Buffer，輕輕吹打使其均勻，再將100 μl的溶液轉移到5 μl的培養管中，加入5 μl的FITC Annexin V染色工作液和10 μl的PI染色工作液，輕輕渦旋細胞，并在室溫、避光的條件下孵育15 min；最后，每個管中加入400 μl的1×Binding Buffer，嚴格避光條件下1 h內完成上機檢測，以免影響結果。

1.3.5免疫印跡法(Western Blotting)

將處于對數生長期的人胃癌SGC-7901細胞吹打制成濃度為6×104個/ml的細胞懸液，設定實驗組和對照組，放入37℃、5%CO2細胞培養箱中培養48 h后，用150-200 μl的工作液進行細胞裂解，并小心收集實驗所需蛋白。參照碧云天生物技術有限公司BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)說明進行BCA工作液配制。并用酶標儀測定A562處的各孔吸光度，測得的每個待測樣品孔和標準孔的吸收值分別減去空白孔平均光吸收值，以校正過的BSA標準蛋白A562測量值對其濃度(μg/ml)作圖繪制標準曲線，最后，根據標準曲線定量待測樣品蛋白濃度。經SDS-PAGE電泳后轉膜?？捎每捡R斯亮藍染色工作液對凝膠進行染色觀察轉膜效果。經過1-2 h的膜封閉，進行抗體孵育，4℃震蕩過夜；次日，TBST洗滌后，在二抗工作液中室溫孵育1-2 h；ECL顯影；用凝膠成像系統分析目的蛋白的表達水平。

1.3.6統計學處理

2 結果

2.1 β-二氫青蒿素-大黃素復合物對人胃癌SGC-7901細胞的抑制增殖作用

MTT的結果顯示出β-二氫青蒿素-大黃素復合物對人胃癌SGC-7901細胞具有明顯抑制增殖作用(見圖1)，并顯示出β-二氫青蒿素-大黃素復合物對人胃癌SGC-7901細胞的生長呈現出量-效和時-效關系。當β-二氫青蒿素-大黃素復合物分別作用24 h、48 h、72 h時，SGC-7901細胞的IC50分別為7.4 μg/ml、4.6 μg/ml、2.4 μg/ml。

圖1 β-二氫青蒿素-大黃素復合物對人胃癌SGC-7901細胞株抑制增殖作用

2.2 β-二氫青蒿素-大黃素復合物對人胃癌SGC-7901細胞的誘導凋亡作用

本實驗利用光學顯微鏡觀察經過HE染色的對照組和實驗組，從而觀察不同濃度的β-二氫青蒿素-大黃素復合物誘導人胃癌SGC-7901細胞凋亡的典型的細胞形態學變化。對照組細胞貼壁良好，形態多為梭形或者多角形，伸展性好，分布均勻，生長旺盛，核仁清晰可見，核分裂像較多見；實驗組分別加入2.5 μg/ml、5 μg/ml、7.5 μg/ml的β-二氫青蒿素-大黃素復合物，作用48 h后，細胞圓化，體積變小，胞核深染，染色質邊集，即胞膜下呈深藍色的半月形，也可見逐漸增加的凋亡細胞比例和凋亡小體。

Hoechst33258染色48 h后經熒光顯微鏡觀察，對照組細胞發出均勻的藍色熒光，且細胞形態正常，胞核完整(圖2A)；實驗組經β-二氫青蒿素-大黃素復合物處理后，細胞變小、圓化，胞漿濃縮，胞核染色質固縮，凝集于胞膜周邊，形成月牙形或碎裂成小塊狀，發出強藍色熒光，略發白，甚至可見凋亡小體。隨著藥物濃度的增加，凋亡細胞的形態越明顯，凋亡細胞數越多(圖2B、圖2C、圖2D)。

Annexin V/PI雙染流式細胞儀檢測分析，分別采集對照組和實驗組早期凋亡，中晚期凋亡及壞死細胞的信息，并繪制成圖像。圖像分為四個象限，左下象限為不被 Annexin V和PI染色的活細胞；右下象限為僅被Annexin V染色的早期凋亡細胞；左上象限主要為壞死細胞，甚至是機械性損傷的細胞；右上象限為可被Annexin V和PI同時染色中晚期凋亡細胞[11](見圖3、4)。經β-二氫青蒿素-大黃素復合物作用48 h后，實驗組早期凋亡率與對照組相比依次增加，且組間具有濃度依賴性?？梢钥陀^反映β-二氫青蒿素-大黃素復合物能誘導人胃癌SGC-7901細胞發生凋亡，該數據差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖2 Hoechst33258熒光染色實驗觀察細胞形態(×400倍)

A：對照組 B：2.5 μg/ml實驗組 C：5 μg/ml實驗組 D：7.5 μg/ml實驗組

2.3 β-二氫青蒿素-大黃素復合物對胃癌SGC-7901細胞抑制增殖作用相關蛋白表達的影響

本實驗運用Western Blotting方法檢測了細胞周期蛋白CyclinD1和細胞增殖核抗原Ki-67的表達變化。發現β-二氫青蒿素-大黃素復合物作用48 h后明顯下調了CyclinD1和Ki-67的表達水平，且藥物濃度越高，蛋白表達下調的越明顯 (見圖5)，可以認為β-二氫青蒿素-大黃素復合物通過調節細胞周期蛋白CyclinD1的表達，干預了細胞增殖周期，抑制其增殖，誘導細胞凋亡。

圖3 流式細胞儀分析Annexin V/PI雙染凋亡率結果

圖4 流式細胞儀分析Annexin V/PI雙染結果

圖5Western Blotting法對CyclinD1和細Ki-67表達的檢測

3 討論

目前以天然抗腫瘤活性成分為先導化合物，并對其進行結構修飾，從而提煉出新型的抗腫瘤復合物是現在抗腫瘤藥物的研發熱點。期望是新型復合物可以發揮原有母體藥物的最大抗腫瘤活性，并減少本身的不足，以便使其更好的應用于抗腫瘤治療中。本實驗所用的β-二氫青蒿素-大黃素復合物是由經典抗腫瘤中草藥-二氫青蒿素和大黃素單體通過酯鍵結合所形成的，而大量研究早已證明二氫青蒿素和大黃素的抗腫瘤作用[12，13]。那么β-二氫青蒿素-大黃素復合物是否具有比二氫青蒿素和大黃素更強的抗腫瘤作用呢？回答是肯定的，本實驗已證明了這一點。通過前期實驗證明：同等劑量，相同時間，同種細胞株的情況下，β-二氫青蒿素-大黃素復合物的細胞毒作用優于大黃素和二氫青蒿素，且對正常細胞沒有傷害。我們的實驗證實β-二氫青蒿素-大黃素復合物可以誘導人胃癌SGC-7901細胞凋亡，抑制增殖，其作用機制與下調了細胞周期相關蛋白CyclinD1和增殖型抗原Ki-67蛋白的表達密切相關。為該復合物具有抗腫瘤作用提供了初步的實驗依據，也淺析了其應用于胃癌治療的可行性，希望能為更好地開發β-二氫青蒿素-大黃素復合物的藥用價值提供幫助。