亞洲棉GaPP2C24基因的克隆及表達(dá)分析

蔡 肖,甄軍波,劉琳琳,劉 迪,唐麗媛,張素君,李興河,王海濤,劉存敬,張香云,張建宏,遲吉娜

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 棉花研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮海半干旱區(qū)棉花生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家棉花改良中心河北分中心,河北 石家莊 050051)

蛋白磷酸酶(Protein phosphatase,PP)是蛋白質(zhì)可逆磷酸化的關(guān)鍵酶,在植物生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用[1]。2C型蛋白磷酸酶(Protein phosphatase 2C type)是一類(lèi)單體絲氨酸/蘇氨酸殘基蛋白磷酸酶,參與生物體多種信號(hào)途徑[2]。從古菌到高等植物,PP2C在進(jìn)化上是相對(duì)保守的。高等植物中的PP2C較其他生物更具多樣性,其蛋白C端具有保守的催化結(jié)構(gòu)域,N端為功能各異的延伸區(qū),廣泛參與ABA信號(hào)調(diào)控、植物生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫應(yīng)答等信號(hào)途徑[3-7]。

Xue等[8]對(duì)擬南芥和水稻中的PP2C成員進(jìn)行了全基因組鑒定,分別找到80,78個(gè)PP2C成員,并將其分別劃分成了13,11個(gè)亞組。擬南芥A組的PP2C蛋白(如ABI1和ABI2)主要參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),通過(guò)與ABA受體蛋白結(jié)合來(lái)調(diào)控ABA響應(yīng),而B(niǎo)組蛋白能刺激絲裂原活化蛋白磷酸激酶(MAPK)信號(hào),C組蛋白則參與花發(fā)育的調(diào)控,這表明PP2C是通過(guò)不同信號(hào)通路調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來(lái)參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)的[9-10]。ABA是重要的植物內(nèi)源激素,在低溫、干旱、鹽堿等非生物脅迫中具有重要作用。擬南芥中的研究表明,PP2C是ABA信號(hào)途徑中關(guān)鍵的負(fù)調(diào)節(jié)因子[11-12]。山毛櫸中有2個(gè)PP2C成員被分離鑒定,其中FsPP2C1在ABA信號(hào)途徑中為負(fù)調(diào)控[13],而FsPP2C2基因的擬南芥過(guò)表達(dá)植株中表現(xiàn)出對(duì)ABA信號(hào)敏感上升,說(shuō)明其是ABA信號(hào)途徑中的正調(diào)控因子[14]。

Shazadee等[15]對(duì)亞洲棉、雷蒙德氏棉、海島棉和陸地棉的PP2C家族成員進(jìn)行了全基因組鑒定,找到的PP2C基因數(shù)量分別為87,99,147,181個(gè)。qRT-PCR分析其中30個(gè)陸地棉GhPP2C基因在非生物脅迫下的表達(dá)發(fā)現(xiàn),大部分基因的轉(zhuǎn)錄受到高溫、低溫、干旱和高鹽脅迫的誘導(dǎo),暗示著PP2C基因在棉花非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。到目前為止,大多數(shù)PP2C基因的功能還未得到深入的研究,棉花干旱響應(yīng)的PP2C基因的研究也少見(jiàn)報(bào)道。

本研究依據(jù)亞洲棉干旱轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果,以石系亞1號(hào)為材料,克隆到GaPP2C24基因,對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)特征分析,研究基因的組織表達(dá)特性和干旱脅迫下的表達(dá)模式,為揭示其干旱響應(yīng)的分子機(jī)制以及棉花抗旱分子育種奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料干旱脅迫處理和取樣

亞洲棉石系亞1號(hào)由河北省農(nóng)林科學(xué)院棉花研究所棉花分子育種研究室種植保存。種子經(jīng)硫酸脫絨后,直接播種于濕潤(rùn)沙子中,子葉展開(kāi)后轉(zhuǎn)移到1/2 Hogland營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行水培。培養(yǎng)條件為白天28 ℃,夜晚26 ℃,濕度70%。當(dāng)植株第2片真葉完全展開(kāi)時(shí)進(jìn)行17%PEG6000模擬干旱脅迫處理,處理時(shí)間為0,1,2,3,5 h。處理后迅速剪取其真葉,液氮速凍,-80 ℃保存。

1.2 GaPP2C24基因克隆

根據(jù)本研究室石系亞1號(hào)干旱轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的PP2C基因序列片段(Cotton_A_12895),利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物(表1)。以干旱處理2 h的石系亞1號(hào)葉片cDNA為模板擴(kuò)增目的基因。PCR擴(kuò)增采用TaKaRa公司的PrimeSTAR HS高保真酶,反應(yīng)體系為50 μL,反應(yīng)條件參照說(shuō)明書(shū)中三步法進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pEASY-T3克隆載體,轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans1-T1,篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序。本研究中引物合成和測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成,RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司,高保真DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄以及熒光定量PCR試劑購(gòu)自TaKaRa,克隆載體、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 GaPP2C24生物信息學(xué)分析

多序列比對(duì)采用Clustalx 1.83和DNAMAN 8.0軟件。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建采用MEGA 5.2軟件。利用ProtParam tool (https://web.expasy.org/protparam/)分析基因編碼蛋白的理化性質(zhì)；蛋白潛在的磷酸化位點(diǎn)和跨膜域分別采用NetPhos 3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)軟件和TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)軟件進(jìn)行在線預(yù)測(cè)。利用CELLO v.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位情況。分別利用SOPM(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopm.html)和SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/interactive)軟件在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4 GaPP2C24基因表達(dá)分析

提取石系亞1號(hào)子葉、胚根、下胚軸,3周齡的葉、根、莖等組織以及模擬干旱脅迫處理0,1,2,3,5 h的葉片總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR分析。設(shè)計(jì)GaPP2C24特異引物GaPP2C24-qRT-F和GaPP2C24-qRT-R(表1),以Histone3為內(nèi)參基因,按照CFX96定量PCR儀(Bio-Rad,USA)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR),3次生物學(xué)重復(fù),采用2-ΔΔCT法分析基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 GaPP2C24基因全長(zhǎng)cDNA的克隆及其編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

根據(jù)本研究室石系亞1號(hào)干旱轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的差異表達(dá)基因Cotton_A_12895設(shè)計(jì)PCR特異引物,以石系亞1號(hào)葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,回收目的條帶(圖1),克隆到pEASY-T3載體上,進(jìn)行測(cè)序分析,測(cè)序結(jié)果與NCBI上公布的亞洲棉(G.arboreum)PP2C24基因序列(XM_017793991.1)一致,其全長(zhǎng)CDS序列大小為1 251 bp,編碼416個(gè)氨基酸,將其命名為GaPP2C24。

M. DL2000 Marker; 1. GaPP2C24基因。M.DL2000 Marker；1. GaPP2C24 gene.

利用ProtParam在線工具分析顯示,GaPP2C24基因編碼蛋白長(zhǎng)度為416個(gè)氨基酸殘基,蛋白分子量為45.380 54 ku,等電點(diǎn)pI為6.07。平均疏水指數(shù)(GRAVY)為-0.332,是親水性蛋白,不穩(wěn)定系數(shù)46.66,屬于不穩(wěn)定蛋白。Netphos分析蛋白磷酸化位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)肽鏈中Serine磷酸化位點(diǎn)最多。SignalP 4.1 Server檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其不含信號(hào)肽。TMHMM預(yù)測(cè)結(jié)果表明,該蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域,為非跨膜蛋白。利用CELLO v.2.5進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),結(jié)果顯示，該蛋白可能定位于細(xì)胞質(zhì)中。

2.2 GaPP2C24基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

SOPM蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,編碼該蛋白的139個(gè)氨基酸可能形成α螺旋(33.41%),107個(gè)氨基酸可能形成延伸帶(25.72%),43個(gè)氨基酸可能形成β轉(zhuǎn)角(10.34%),127個(gè)氨基酸可能形成無(wú)規(guī)則卷曲(30.53%)(圖2)。利用SWISS-MODEL工具進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致(圖3)。

藍(lán)色.α螺旋；紅色.延伸帶；綠色.β轉(zhuǎn)角；紫色.無(wú)規(guī)則卷曲。Alpha helix, extended strand, beta turn and random coil are represented by blue, red, green and purple,respectively.

圖3 預(yù)測(cè)的GaPP2C24蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 The predicted tertiary structure of GaPP2C24 protein

2.3 GaPP2C24蛋白同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

將GaPP2C24氨基酸序列提交到NCBI進(jìn)行BlastP比對(duì),結(jié)果表明,GaPP2C24與可可樹(shù)(EOY33930.1)、黃麻(OMO91132.1)的PP2C蛋白的相似性較高,分別為85%和84%,與擬南芥(NP_172223.1)的相似性為56%。選取可可樹(shù)(EOY33930.1)、黃麻(OMO91132.1)、棗(XP_015873860.1)、桑樹(shù)(XP_010106553.1)、甜橙(XP_006488392.1)、葡萄(XP_002282608.1)、胡楊(XP_011032242.1)、麻風(fēng)樹(shù)(XP_012066955.1)、煙草(XP_009599862.1)和擬南芥(NP_172223.1)10個(gè)代表性物種的PP2C氨基酸序列,與本研究克隆的GaPP2C24進(jìn)行了氨基酸序列多重比對(duì)。結(jié)果表明,不同物種來(lái)源的PP2C在氨基酸序列上保守性較高(圖4)。進(jìn)化分析表明,本研究克隆的PP2C編碼蛋白與黃麻(OMO91132.1)和可可樹(shù)(EOY33930.1)聚在一支,其中與黃麻(OMO91132.1)的進(jìn)化距離最近,與擬南芥(NP_172223.1)進(jìn)化上的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖5)。

GaPP2C24.亞洲棉Cotton_A_12895；TcPP2C.可可樹(shù)EOY33930.1；CoPP2C. 黃麻OMO91132.1；ZjPP2C.棗XP_015873860.1；MnPP2C.桑樹(shù)XP_010106553.1；CsPP2C. 甜橙XP_006488392.1；VvPP2C. 葡萄XP_002282608.1；PePP2C. 胡楊XP_011032242.1；JcPP2C. 麻風(fēng)樹(shù)XP_012066955.1；NtPP2C. 煙草XP_009599862.1；AtPP2C.擬南芥NP_172223.1。

GaPP2C24.GossypiumarboreumCotton_A_12895；TcPP2C.TheobromacacaoEOY33930.1；CoPP2C.CorchorusolitoriusOMO91132.1；ZjPP2C.ZiziphusjujubeXP_015873860.1；MnPP2C.MorusnotabilisXP_010106553.1；CsPP2C.CitrussinensisXP_006488392.1；VvPP2C.VitisviniferaXP_002282608.1；PePP2C.PopuluseuphraticaXP_011032242.1；JcPP2C.JatrophacurcasXP_012066955.1；NtPP2C.NicotianatomentosiformisXP_009599862.1；AtPP2C.ArabidopsisthalianaNP_172223.1.

圖4 GaPP2C24與不同植物的PP2C氨基酸序列多重比對(duì)
Fig.4 Alignment of amino acid sequences of GaPP2C24 and PP2Cs from different plant species

圖5 GaPP2C24與其他物種PP2C氨基酸序列的進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of GaPP2C24 and PP2Cs from other species

2.4 GaPP2C24基因表達(dá)分析

為了解GaPP2C24基因的組織表達(dá)特性,以石系亞1號(hào)為材料,分析了不同組織中基因的表達(dá)變化情況。如圖6所示,GaPP2C24在幼苗期的莖和根中表達(dá)量較高,分別是萌發(fā)期子葉中的3.2,3.0倍。在所有檢測(cè)的組織中,GaPP2C24在幼苗期葉片中的表達(dá)量最低,與其他部位的表達(dá)量差異均達(dá)到顯著水平。

小寫(xiě)字母a、b、c、d表示不同樣本之間存在顯著差異(P<0.05)。圖7同。a, b, c and d showed significant difference between different samples (P<0.05).The same as Fig.7.

以石系亞1號(hào)幼苗期干旱脅迫處理不同時(shí)間的根、莖和葉為材料,分析GaPP2C24基因在干旱響應(yīng)中的表達(dá)變化情況(圖7)。干旱處理后,根和葉中GaPP2C24基因與對(duì)照相比均顯著上調(diào)表達(dá)。在干旱處理1 h時(shí),葉和根中GaPP2C24的表達(dá)量就達(dá)到了最大值,分別為對(duì)照的6.9,53.9倍。在干旱脅迫1,2,3 h的根中,該基因的表達(dá)量顯著增強(qiáng),分別為對(duì)照的53.9,51.6,48.3倍。在干旱脅迫處理1,2,3 h的莖中,該基因的表達(dá)也顯著上調(diào),且在處理3 h達(dá)到最大值,為對(duì)照的5.9倍。

圖7 干旱脅迫下石系亞1號(hào)葉片中GaPP2C24基因的表達(dá)分析Fig.7 Expression pattern of GaPP2C24 gene in Shixiya-1 leaves under drought stresses

3 討論

干旱嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和纖維品質(zhì)。目前，與抗旱相關(guān)蛋白磷酸酶的研究主要集中在擬南芥、水稻等植物上,與棉花抗旱性有關(guān)的蛋白磷酸酶的研究較少。PP2C是一個(gè)多基因家族[16-19],在植物中數(shù)量眾多,具有相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)特征。在擬南芥中已分離到80個(gè)PP2C基因[1,8]。Xue等[8]根據(jù)遺傳進(jìn)化關(guān)系和功能將擬南芥PP2C基因家族劃分為13個(gè)亞組(A、B、C、D、E、G、H、I、J、K、L、F1和F2),而水稻PP2C家族基因可以劃分成11個(gè)亞組(A、B、C、D、E、G、H、I、K、F1和F2)。Shazadee等[15]將鑒定的87個(gè)亞洲棉PP2C基因與擬南芥PP2C基因進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析,將亞洲棉PP2C基因分成了11個(gè)亞組(A-K)。本研究所克隆的GaPP2C24(Cotton_A_12895)基因?qū)儆贏亞組。

GaPP2C24基因編碼蛋白長(zhǎng)度為416個(gè)氨基酸殘基,分子量為45.380 54 ku,等電點(diǎn)pI為6.07。該蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域,為非跨膜蛋白,亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),GaPP2C24蛋白和同是錦葵科的黃麻、可可親緣關(guān)系最近,與擬南芥中的NP_172223.1相似性56%,表明PP2C在進(jìn)化中相對(duì)保守。

大多數(shù)的擬南芥A組的PP2C基因表達(dá)受到ABA、低溫、干旱等多種逆境脅迫的誘導(dǎo),說(shuō)明它們?cè)诜巧锩{迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。研究表明,水稻、谷子、花生中A組的PP2C成員也能不同程度地響應(yīng)ABA、干旱、高鹽、低溫等非生物逆境脅迫[8,20-21]。本研究對(duì)克隆得到的亞洲棉GaPP2C24基因進(jìn)行了干旱脅迫下的表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)受干旱脅迫的誘導(dǎo),這暗示了該基因可能在干旱應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。

本研究克隆得到一個(gè)亞洲棉干旱響應(yīng)的PP2C基因GaPP2C24,對(duì)其進(jìn)行了組織表達(dá)特性和干旱脅迫表達(dá)模式分析,這將為后續(xù)開(kāi)展基因功能研究、闡明干旱響應(yīng)下分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。