擬南芥突變體sus40-1D的遺傳分析與候選基因鑒定

邳瑞雪,杜 亮,李 娜,欒維江,李云海

(1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300387；2.中國(guó)科學(xué)院 遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 植物細(xì)胞與染色體工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100101)

器官的大小作為植物重要的形態(tài)特征是其進(jìn)化與適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果；同時(shí),器官大小的調(diào)控也是一個(gè)重要的生物學(xué)過(guò)程。研究器官大小調(diào)控的分子機(jī)制對(duì)作物生物量的改良具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多調(diào)控植物器官大小的基因,但是器官大小調(diào)控的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不清楚。進(jìn)一步分離和鑒定器官大小變異突變體有助于深入了解器官大小調(diào)控的分子機(jī)制,并且為分子育種改良提供理論基礎(chǔ)和基因資源。

植物器官的最終大小是由細(xì)胞的數(shù)目和細(xì)胞的大小所決定[1-3]。植物的器官在發(fā)育時(shí)分為2個(gè)連續(xù)的階段。第一階段是器官原基中的細(xì)胞進(jìn)行分裂,分裂達(dá)到一定的數(shù)目后就會(huì)停止,細(xì)胞體積變化不大。第二階段是細(xì)胞開始進(jìn)行擴(kuò)展,細(xì)胞的體積開始增加。細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)展的協(xié)同調(diào)控決定了最終的器官大小[2]。到目前為止,在模式植物擬南芥中已發(fā)現(xiàn)許多影響器官大小的因子,包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控、激素信號(hào)調(diào)控通路及蛋白質(zhì)合成與修飾等多個(gè)水平和途徑[4-5]。其中通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞分裂來(lái)影響器官生長(zhǎng)的基因有：AUXIN-REGULATEDGENEINVOLVEDINORGANSIZE(ARGOS)、GROWTHREGULATINGFACTOR(GRF)、KLUH(KLU)/CYP78A5和JAGGED(JAG)等[6-10]。有些基因能夠通過(guò)抑制細(xì)胞分裂調(diào)控器官大小。例如,過(guò)量表達(dá)ROTUNDIFOLIA4(ROT4)的突變體rot4-1D,其葉片的細(xì)胞分裂受到抑制,表現(xiàn)出變短變圓的表型[11]。擬南芥DA1基因編碼一個(gè)泛素受體蛋白。da1-1突變體外珠被細(xì)胞數(shù)目增多,種子花瓣均增大。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,DA1通過(guò)細(xì)胞分裂來(lái)調(diào)控種子大小[12]。eod1(enhancerofda1-1)是da1-1突變體的增強(qiáng)子,EOD1/BIGBROTHER(BB)編碼一個(gè)E3泛素連接酶。過(guò)表達(dá)EOD1/BB時(shí),其花瓣和葉片都變小。DA1與EOD1/BB協(xié)同抑制細(xì)胞分裂來(lái)調(diào)控器官的大小[13-14]。此外,也發(fā)現(xiàn)了一些基因能夠通過(guò)影響細(xì)胞擴(kuò)展調(diào)控器官大小。當(dāng)過(guò)量表達(dá)ORGANSIZERELATED2(OSR2)時(shí)細(xì)胞的擴(kuò)展得到增強(qiáng),植物器官明顯增大。BIGPETAL(BPEp)與AUXINRESPONSEFACTOR8(ARF8)發(fā)生相互作用,在花瓣發(fā)育的后期協(xié)同限制細(xì)胞擴(kuò)展[15-16]。

李云海課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)了器官大小的重要調(diào)控因子UBIQUITIN SPECIFIC PROTEASE15 (UBP15)/SUPPRESSOR2 OF DA1 (SOD2)。UBP15是一個(gè)泛素特異的蛋白酶,通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的分裂來(lái)調(diào)控器官的大小[17]。突變體sod2-1的器官與野生型相比顯著變小。UBP15與器官大小的正調(diào)控因子DA1能夠直接發(fā)生互作,并且UBP15作為泛素受體DA1的一個(gè)直接下游底物,其蛋白穩(wěn)定性受DA1的調(diào)節(jié)。在遺傳上,sod2-1能夠完全抑制da1-1器官變大的表型。因此,DA1-UBP15是一個(gè)重要的器官大小調(diào)控途徑。

為了進(jìn)一步鑒定DA1-UBP15途徑的新成員或新的器官大小的調(diào)控因子,在sod2-1的背景下通過(guò)甲基硫酸乙酯(Ethyl-methanesulphonate,EMS)誘變篩選得到sod2-1的抑制子突變體suppressorsofsod2(sus40-1D),對(duì)sus40-1Dsod2-1突變體的花瓣和種子與sod2-1進(jìn)行對(duì)比分析,并通過(guò)F2群體構(gòu)建與重測(cè)序分析挖掘sus40-1D的候選基因,為更好了解植物器官大小調(diào)控的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和生長(zhǎng)條件

以擬南芥突變體sod2-1為原始材料,經(jīng)EMS誘變獲得了器官變大的突變體sus40-1Dsod2-1。將sod2-1與sus40-1Dsod2-1進(jìn)行雜交獲得F1,并通過(guò)F1植株自交得到F2。F2群體用于基因的定位研究。試驗(yàn)所用野生型材料為擬南芥Columbia生態(tài)型(Col-0)。生長(zhǎng)的溫度為22 ℃,光照周期為16 h光照/8 h黑暗。

1.2 分析方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)分析 花瓣、子葉和種子的測(cè)量：將花瓣或子葉放在1%的瓊脂培養(yǎng)基上鋪平,在體式顯微鏡(LEICA S8APO)下進(jìn)行拍攝,種子的大小用體式顯微鏡拍攝。照片利用Image J軟件測(cè)量器官的面積。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。

1.2.2 遺傳分析 突變體sod2-1與sus40-1Dsod2-1雜交獲得F1群體,考察F1植株的表型。F1自交構(gòu)建F2分離群體,待植株開花后考察F2分離群體中單株的形態(tài),統(tǒng)計(jì)器官變小突變體單株和器官變大突變體單株的數(shù)目并進(jìn)行卡方適合性檢測(cè)。

1.2.3 重測(cè)序篩選基因 對(duì)sod2-1與sus40-1Dsod2-1雜交的F2分離群體,在開花后對(duì)器官變大和器官變小的植株各選取45株剪取葉片,然后把各45個(gè)樣品等量混合進(jìn)行DNA提取。利用高通量測(cè)序與MutMap[18-19]技術(shù)分析篩選突變基因。將測(cè)序所得的2份混池?cái)?shù)據(jù)以野生型Col-0基因組做比對(duì)獲得SNPs數(shù)據(jù)群,將野生型與混池都含有的SNPs去除,獲得混池所特有的SNPs數(shù)據(jù)。計(jì)算每個(gè)SNP的突變頻次與該位點(diǎn)總深度的比值(SNP-index),SNP-index為1時(shí),其SNP與表型連鎖。進(jìn)一步挑選特異SNPs數(shù)據(jù)中SNP-index為1的SNP為候選基因。

1.2.4 dCAPS標(biāo)記 利用dCAPS分子標(biāo)記網(wǎng)站在線分析,挑選適合的限制性內(nèi)切酶和上下游引物,PCR擴(kuò)增后酶切即可作為合適的dCAPS標(biāo)記。選定2個(gè)dCAPS標(biāo)記位點(diǎn)用來(lái)突變位點(diǎn)驗(yàn)證和目的基因的連鎖分析(表1)。

表1 用于dCAPS分析的引物及酶Tab.1 Primers and enzymes for dCAPS analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體sus40-1Dsod2-1的分離與鑒定

前期研究表明,器官大小調(diào)控因子UBP15/SOD2通過(guò)影響細(xì)胞的增殖來(lái)控制器官大小。為了更好研究UBP15在器官大小中的調(diào)控機(jī)制,通過(guò)對(duì)sod2-1突變體種子進(jìn)行EMS化學(xué)誘變處理并進(jìn)行遺傳篩選尋找sod2-1突變體的抑制子。試驗(yàn)結(jié)果表明,在M2中成功篩選能抑制sod2-1表型的突變體,得到了多個(gè)sod2-1的抑制子突變體,這些抑制子被命名為suppressorsofsod2-1(簡(jiǎn)稱sus),其中一個(gè)突變體(sus40-1D)顯著抑制sod2-1的器官大小的表型(圖1-A)。

2.2 sus40-1D抑制了sod2-1的種子和器官大小表型

對(duì)主莖上第4～10個(gè)花瓣和成熟角果的測(cè)量結(jié)果顯示,sod2-1的種子面積比野生型顯著減少了17%,而sus40-1Dsod2-1則比野生型顯著增加了16%,同時(shí)相對(duì)sod2-1,種子面積顯著變大(圖1-B,E)；sod2-1花瓣面積比野生型顯著減少了22%,而突變體sus40-1Dsod2-1比野生型顯著增加了21%(圖1-C,E)；對(duì)萌發(fā)10 d的子葉測(cè)量發(fā)現(xiàn)，sus40-1Dsod2-1突變體子葉較sod2-1也顯著變大(圖1-D,E)。這些結(jié)果表明,sus40-1D在器官和種子大小方面均能抑制sod2-1的表型。

2.3 突變體sus40-1D的遺傳分析

將突變體sus40-1Dsod2-1與sod2-1雜交獲得F1,考察F1植株葉片的表型,其大小均表現(xiàn)為sus40-1Dsod2-1的表型。F1自交構(gòu)建F2分離群體,于開花后考察F2分離群體并統(tǒng)計(jì)168株單株葉片植株的形態(tài),統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,表現(xiàn)為sod2-1表型的有45株,表現(xiàn)為sus40-1Dsod2-1表型的有123株。卡方適合性檢測(cè)結(jié)果顯示,F2的分離符合3∶1的分離規(guī)律。以上試驗(yàn)結(jié)果表明,該突變體器官變大性狀受一對(duì)顯性基因控制(表2)。

2.4 候選基因的篩選與鑒定

A.野生型Col-0、sod2-1和sus40-1Dsod2-1的植株形態(tài)(標(biāo)尺：2 cm)。B.野生型Col-0、sod2-1和sus40-1Dsod2-1的種子(標(biāo)尺：1 mm)。C.野生型Col-0、sod2-1和sus40-1Dsod2-1的花瓣(標(biāo)尺：1 mm)。D.野生型Col-0、sod2-1和sus40-1Dsod2-1的子葉(標(biāo)尺：2 mm)。E.野生型Col-0、sod2-1和sus40-1Dsod2-1的種子面積、花瓣面積和子葉面積的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(n≥50)。不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

A. Plants of Col-0,sod2-1andsus40-1Dsod2-1(Scale bar: 2 cm). B. Seeds of Col-0,sod2-1andsus40-1Dsod2-1(Scale bar: 1 mm) . C. Petals of wild-type Col-0,sod2-1andsus40-1Dsod2-1(Scale bar: 1 mm). D. Cotyledons of Col-0,sod2-1andsus40-1Dsod2-1(Scale bar: 2 mm). E. Seed area, petal area and cotyledon area of Col-0,sod2-1andsus40-1Dsod2-1(n≥50).Different letters indicate significant differences (P<0.05).

圖1 突變體表型及相關(guān)性狀分析
Fig.1 Analysis of mutant phenotypes and related traits

表2 遺傳分析Tab.2 Genetic analyses

為了鑒定sus40-1D突變位點(diǎn),從sus40-1Dsod2-1與sod2-1雜交的F2群體中,選取了45株sus40-1Dsod2-1表型和45株sod2-1表型的單株分別等量混合提取DNA并進(jìn)行全基因組重測(cè)序。重測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果共檢測(cè)出3 108個(gè)SNP,連鎖分析發(fā)現(xiàn)位于1號(hào)染色體上的SNP與sus40-1Dsod2-1存在表型連鎖。由于sus40-1D是顯性突變,因此,在重測(cè)序的F2群體中sus40-1Dsod2-1表型植株的基因型為純合突變體或雜合型,重測(cè)序的F2群體中sod2-1表型植株的基因型為野生型,說(shuō)明這些SNPs可能與突變表型連鎖。

表3 突變位點(diǎn)分析Tab.3 Analyses of mutation sites

A.候選基因1:At1g05820的基因結(jié)構(gòu)圖；B.候選基因2:At1g08470的基因結(jié)構(gòu)圖；C.候選基因1的部分F2群體驗(yàn)證；D.候選基因2的部分F2群體驗(yàn)證。A. The gene structure of candidate gene 1:At1g05820; B. The gene structure of candidate gene 2:At1g08470; C. Partial F2 population verification of candidate gene 1; D. Partial F2 population verification of candidate gene 2.

對(duì)于1號(hào)染色體突變位點(diǎn)的分析結(jié)果(表3)顯示,其中有2個(gè)突變位點(diǎn)在外顯子區(qū),另外3個(gè)突變位點(diǎn)發(fā)生在內(nèi)含子、基因間和基因上游。針對(duì)這些SNPs開發(fā)dCAPS標(biāo)記并利用F2分離群體的2種表型植株進(jìn)行上樣檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其中的2個(gè)SNP與表型發(fā)生共分離,這2個(gè)SNP分別發(fā)生在At1g05820和At1g08470基因上。其中,SNP1發(fā)生在At1g05820的內(nèi)含子區(qū)(圖2-A)；SNP2發(fā)生在At1g08470的外顯子區(qū),在2683407處發(fā)生由G變?yōu)锳的堿基突變,導(dǎo)致了非同義突變,由絲氨酸轉(zhuǎn)變成苯丙氨酸,從而導(dǎo)致了蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變(圖2-B)。

根據(jù)At1g05820、At1g08470基因上的突變位點(diǎn),分別設(shè)計(jì)了dCAPS1和dCAPS2 2個(gè)分子標(biāo)記。基于這2個(gè)標(biāo)記對(duì)突變體與野生型的分析結(jié)果表明,突變體sus40-1Dsod2-1中的2個(gè)候選基因的確發(fā)生了突變。對(duì)120個(gè)F2分離群體的檢測(cè)結(jié)果顯示,該突變位點(diǎn)與表型共分離,基因與表型完全連鎖(圖2-C,D)。試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了At1g05820與At1g08470為sus40-1D突變體的候選基因。考慮到SNP2發(fā)生在At1g08470的外顯子區(qū),并導(dǎo)致了氨基酸的改變,因此，At1g08470是最可能的候選基因。

3 結(jié)論與討論

植物器官大小是十分重要的數(shù)量性狀,其分子調(diào)控機(jī)制研究在理解植物生長(zhǎng)發(fā)育與促進(jìn)農(nóng)作物豐產(chǎn)方面具有重要的生物學(xué)意義。目前，已經(jīng)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多調(diào)控植物器官大小的基因,但是具體的分子調(diào)控機(jī)制還未能詳細(xì)闡述。鑒定發(fā)現(xiàn)更多的參與器官大小調(diào)控的基因,并闡明器官大小調(diào)控因子之間的相互關(guān)系,有助于深入了解器官大小調(diào)控的內(nèi)在機(jī)理并最終應(yīng)用到農(nóng)作物的分子改良研究中。

前期研究表明DA1能夠切割UBP15/SOD2從而調(diào)控植物器官大小,但是UBP15/SOD2下游成員并不清楚。本研究通過(guò)在sod2-1背景下遺傳篩選并獲得一個(gè)抑制子突變體sus40-1Dsod2-1,其植株表現(xiàn)出較大的子葉、花瓣與種子。利用基因組重測(cè)序技術(shù)和連鎖分析對(duì)突變導(dǎo)致植株變大表型的SNP進(jìn)行篩查,最終確定位于1號(hào)染色體的At1g05820和At1g08470為候選基因。進(jìn)一步通過(guò)分子標(biāo)記對(duì)F2群體分析也進(jìn)一步證實(shí),這2個(gè)突變位點(diǎn)與表型共分離。

基于蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),At1g05820編碼一個(gè)類信號(hào)肽酶SPPL5,在擬南芥中SPPL共有AtSPPL1～AtSPPL55種,屬于信號(hào)肽酶SPP的同系物。序列分析表明，SPPL具有疏水性高的跨膜結(jié)構(gòu)域,現(xiàn)已經(jīng)在人類和其他脊椎動(dòng)物中鑒定出具有相似結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)[20-21]。在斑馬魚中敲除SPP或SPPL3會(huì)引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能缺陷并導(dǎo)致細(xì)胞死亡[22],在果蠅和秀麗隱桿線蟲中SPP敲除則會(huì)導(dǎo)致幼蟲發(fā)育異常[23]。在植物中,SPPL5的功能卻鮮有報(bào)道。以上這些結(jié)果表明,SPP和SPPL在基本生命過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。At1g08470基因編碼異胡豆苷合成酶類似基因(STRICTOSIDINESYNTHASE-LIKE3,SSL3),與中華白菜基因存在同源性,但SLL3基因鮮有報(bào)道。在擬南芥中SSL基因分為不同的組,串聯(lián)排列在3號(hào)染色體上的4個(gè)基因(AtSSL4-AtSSL7)與果蠅和秀麗隱桿線蟲的SSL基因相似[24]。SSL5-73個(gè)基因在植株正常狀態(tài)下中低水平表達(dá),在面臨各種刺激下能夠被誘導(dǎo)表達(dá)。而SSL4在植物中具備相對(duì)較高的基礎(chǔ)水平表達(dá),但誘導(dǎo)表達(dá)作用并不明顯。本研究中檢測(cè)到在SSL3基因第2個(gè)外顯子區(qū)發(fā)生堿基置換導(dǎo)致非同義突變,由絲氨酸替換成苯丙氨酸。由于sus40-1D突變是一個(gè)顯性突變,該氨基酸的改變可能增強(qiáng)了該蛋白的功能。

綜上所述,本試驗(yàn)通過(guò)遺傳篩選得到了sod2-1的抑制子突變體sus40-1D,并利用重測(cè)序技術(shù)、連鎖分析和dCAPS分子標(biāo)記對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行鑒定,得到了2個(gè)候選基因At1g05820和At1g08470。這一發(fā)現(xiàn)為DA1-UBP15的下游途徑提供了遺傳基礎(chǔ)。未來(lái)需要構(gòu)建基因組互補(bǔ)載體對(duì)sus40-1Dsod2-1突變體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化與功能驗(yàn)證,最終確定真正SUS40基因。