2014-2019年國家玉米區域試驗參試組合DNA指紋檢測及遺傳多樣性分析

易紅梅,任 潔,王 璐,王 蕊,葛建镕,王鳳格,趙久然,徐明良

(1.中國農業大學 國家玉米改良中心,北京 100094；2.北京市農林科學院 玉米研究中心,玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室,北京 100097)

玉米目前是全球第一大作物,也已躍升為我國第一大作物,經濟地位和戰略地位日益提升,成為政府保證糧食持續增產的最大戰略需求。隨著我國種業的快速發展,玉米審定品種數量呈逐年上升趨勢,目前我國已通過國家或省級審定的品種近1.3萬個(截止到2019年),尤其是近幾年隨著深化種業“放、管、服”,激發育種人員快速釋放科技創新積極性,新品種審定進入了快車道,2016-2019年審定玉米品種近5 700個,國家及各省區試、聯合體、綠色通道參試品種數量每年接近8 000個。隨著玉米品種數量逐年增多,少數骨干親本的集中應用,品種間的遺傳差異越來越小,難以進行有效甄別,如何從源頭控制品種多、亂、雜,并有效地管理和甄別數量龐大的玉米品種成為管理的難題[1]。

我國從2002年起開始開展DNA指紋在國家玉米區域試驗樣品真實性檢測中的研究與應用[2-3],2005年遼寧、吉林、河北、河南、山東、四川等重要玉米種植地區開始采用DNA檢測參試組合真實性,2012年基本覆蓋到全國各省、自治區。2016年隨著農作物品種審定制度的改革和參試渠道的擴寬,國家區試和國家聯合體、省區試和省聯合、綠色通道、自主試驗等參試渠道參試的組合數量出現了爆發式的增長,2002年至今已累計檢測42 826個玉米參試組合樣品的DNA真實性。水稻[4]、小麥[5-6]、大豆[7-8]、油菜[9-10]、棉花[11]、馬鈴薯[12]、花生[13]、芝麻[14]等作物區域試驗也在采用DNA指紋技術對參試組合進行檢測,并作為品種審定的依據和參考。

分子標記在區域試驗參試組合檢測中發揮以下作用：一是構建參試組合DNA指紋數據庫,分析參試組合的遺傳多樣性以及品種選育趨勢；二是檢測同一參試組合不同年份、不同組別是否存在同名更換；三是對每一份參試組合進行特異性檢測,與所有已知品種及同時參試的組合進行比對,從分子水平檢測是否具備特異性；四是對參試組合進行一致性、穩定性、純度測試。DNA指紋在我國品種區域試驗中的深入應用,為我國品種管理提供了有效的技術支撐,防止參試組合更換親本,以及與已知品種相近的問題,從源頭解決品種的多、亂、雜的問題。本研究對2014-2019年國家玉米區域試驗樣品進行DNA指紋的檢測和遺傳多樣性分析,全面了解我國近幾年國家玉米參試組合的多樣性、選育水平、發展趨勢和存在的問題。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2014-2019年國家區試參試組合2 949份,其中2014年294份,2015年430份,2016年524份,2017年576份,2018年538份,2019年587份。包括青貯組(QZ)、西南組(XN)、東南組(DN)、爆裂組(BL)、極早熟組(JZS)、東華北組(DHB)、西北組(XB)、黃淮海組(HHH)、鮮食玉米組(包括甜玉米和糯玉米)(XS)、機收組(JS)、熱帶和亞熱帶組(RD)。樣品信息詳見表1,其中鮮食玉米組參試組合包括糯玉米和甜玉米,雖然甜玉米與糯玉米的遺傳背景不同,但兩者與其他組別遺傳背景差異較大,合并為鮮食組進行分析。

表1 樣品信息表Tab.1 Sample information sheet

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 每份供試樣品均隨機抽取50粒種子形成混合樣品,采用CTAB法提取DNA。

1.2.2 PCR擴增 模板DNA 3 μL,0.25 μmol/L引物,1×PCR Buffer,0.15 μmol/L dNTP,2.5 μmol/L MgCl2,1 UTaq酶,反應總體積為20 μL。每對引物中的一條5′端用熒光染料標記,選用PET、NED、VIC、FAM 4種熒光染料(Applied Biosystems, USA公司合成)。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min,1個循環；94 ℃變性40 s,60 ℃退火35 s,72 ℃延伸45 s,共35個循環；72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

1.2.3 檢測擴增產物 毛細管電泳：PCR產物在毛細管熒光電泳系統ABI 3730XL DNA分析儀 (Applied Biosystems,USA)上進行電泳,在96孔電泳板的單個孔中分別加入1.5 μL PCR產物、9 μL甲酰胺、0.1 μL分子量內標(GeneScanTM-500 LIZ)。95 ℃變性5 min,4 ℃保存10 min,1 000 r/min離心1 min后,于AB 3730XL DNA分析儀上進行電泳。預電泳時間為15 kV,2 min；電泳時間為15 kV,20 min。用Date Collection V1.0軟件收集原始數據。

1.2.4 真實性檢測 參試組合真實性檢測參考NY/T 1432-2014《玉米品種鑒定規程 SSR標記法》。參試組合近似品種篩查對照樣品庫包括6 039份農業部征集審定品種標準樣品、1 861份農業部品種權保護標準樣品、同年度及上一年度的參試樣品。

1.2.5 遺傳分析 采用PowerMarker V3.25軟件對等位變異數、基因多樣性、雜合率和多樣性信息(Polymorphism information content, PIC)進行分析,基于UPGMA(Unweighted pair-group method with arithmetic means)方法的Nei′s (1972)遺傳距離進行不同區組的聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同年份和不同區組多樣性的比較

不同年份參試組合多樣性分析結果表明(表2),2014-2019年國家區試參試組合年際間的PIC、雜合率和遺傳多樣性基本一致,由于2014和2015年樣品數量較少,2014和2015年參試組合的平均基因型數略低于2016-2019年。不同組別參試組合多樣性分析結果表明(表3),爆裂組和西北組的PIC和遺傳多樣性較低,尤其是爆裂組,各指標都低于其他組別；鮮食、青貯和西南3個組別的PIC和遺傳多樣性較高。

表2 2014-2019年不同年份參試組合多樣性比較Tab.2 Genetic diversity comparison of national regional trail in 2014-2019

表3 不同區組參試組合多樣性比較Tab.3 Genetic diversity comparison among different regional trail group

2.2 不同區組之間的遺傳距離與聚類分析

分析各區組之間的遺傳距離和遺傳聚類圖,結果(表4、圖1)表明,爆裂組與其他區組遺傳距離最遠,遺傳聚類時單獨成群,其次是熱帶亞熱帶、鮮食和極早熟組,東華北和西北之間遺傳距離最小。機收組分為機收東北組和機收黃淮海組,2個不同區域機收組之間的遺傳差異低于2個區域的常規品種。黃淮海、東華北、西北、機收幾個組別之間遺傳背景有一定的差異,但遺傳背景相似比例明顯高于其他組別。

表4 不同組別之間的Nei′s(1972)遺傳距離Tab.4 Nei′s (1972) genetic distance among different regional trail groups

圖1 不同區組之間基于UPGMA法的Nei′s遺傳聚類圖Fig.1 UPGMA cluster diagram of different trail group (Nei′s)

2.3 參試組合DNA指紋檢測與分析

2014-2019年2 949份參試組合共檢測出1 152組同名組合,其中1 088組不同來源的同名組合DNA指紋一致,64組不同來源的同名組合DNA指紋差異位點≥2,說明親本組合發生更換,更換組合的樣品占比2.17%。更換組合的樣品與對照差異位點大部分在6個以上,表明大部分更換的組合與原組合差異明顯。2 949份參試組合與已審定、品種權保護、同一年度及上一年度參試組合比較,共篩查出187套相似品種信息,即6.30%的參試組合與其他品種或組合DNA指紋無明顯差異,西北組、東華北組和黃淮海組篩查出的相似品種比例較高,分別為12.90%,10.30%,7.80%,東南組、鮮食組和爆裂組篩查出的相似品種比例較低,分別為1.50%,0.70%,0(圖2)。

圖2 不同區組篩查出的近似品種比例Fig.2 Proportion of similar varieties detected in different groups

2.4 參試樣品與數據庫比較差異位點分布

2014-2019年國家區試參試組合與已審定品種、品種權保護品種以及同一年度和上一年度所有參試組合兩兩比對,年際間隨機2個品種的差異位點的分布基本一致,主要分布在28～36個位點之間,表明參試組合整體具有較高的多樣性(圖3)。2014-2019年的參試組合與數據庫比對篩查最近似品種,DNA指紋差異位點在5個以內的品種數呈逐漸下降趨勢,表明遺傳背景相近的品種比例逐年降低。與數據庫比較篩查每個參試組合的最近似品種信息,2014年參試組合與最近似品種比較,頻率最高的DNA指紋差異位點為16個,2015-2016年為15個,2017-2019年為13個,表明參試組合之間及與已知品種遺傳背景相似性逐年提高(圖4)。

圖3 不同年份國家區試參試組合間差異位點數分布 Fig.3 Distribution of the number of differential sites among the national regional trail varieties in different years

圖4 不同年份參試組合與最近似品種比較差異位點分布Fig.4 Distribution of the most similar variety difference sites in different years

3 結論與討論

3.1 2014-2019年國家區試參試組合遺傳背景的變化趨勢

本研究結果表明,隨著玉米區域試驗持續采用DNA指紋進行檢測同名更換和非同名相近的問題,遺傳背景相近的參試組合比例在逐年降低,表明直接拿其他品種換名參試或進行高度模仿育種的比例在減少,DNA指紋的持續監控能從源頭發揮清理品種多、亂、雜的作用。與王鳳格等[15]研究結果比較,本研究分析的2014-2019年國家區試參試組合的基因型數量、等位基因數量、基因多樣性、PIC、雜合率均有所提高,表明近10 a來我國玉米選育品種遺傳變異和遺傳多樣性日趨豐富。2014-2019年不同年際間國家區試玉米參試組合之間遺傳多樣性和差異位點分布基本一致,說明近幾年國家區域試驗參試組合遺傳多樣性變化不大,但參試組合與數據庫比對最近似品種的差異位點數在減少,側面反映了近幾年來,其他來源參試組合的遺傳背景相似度提高了,表明參試組合的激增并未帶來種質的創新,參試組合間的遺傳背景在逐漸變窄。在不同區組的參試組合中,爆裂組的參試組合多樣性水平最低,可能是由于爆裂玉米參試品種參試單位和參試品種較少,關鍵種質資源相似所致。

3.2 DNA指紋在玉米區域試驗中的應用

區域試驗是品種審定的重要依據,近幾年我國玉米參試組合數量年均達到8 000份,如何準確檢測每個品種是否具有特異性,是我國目前品種管理面臨的難題,也給DNA指紋技術在區域試驗中的應用帶來了挑戰。雖然2014-2019年檢測出的近似品種比率呈現逐年下降的趨勢,但由于參試組合數量的大幅增加,每年檢測出的DNA指紋相近的品種的絕對數量增加幅度較大。隨著分子標記輔助育種技術的不斷發展,以及轉基因、基因編輯品種的研發,在原有優異品種基礎上進行微改良的新品種成為DNA鑒定的難點。隨著我國知識產權保護力度的不斷增加,為了鼓勵原始創新,行業內有人士提出將現行行業標準DNA指紋差異位點判定閾值從“2”調整到“4”。根據近年國家及各省區試、聯合體、綠色通道的參試品種信息,SSR差異位點每提高1個將影響約5%的參試組合,根據近幾年的參數組合數量計算,1個位點將影響約400個參試組合。DNA指紋差異位點閾值的調整對我國玉米品種選育影響較大,差異位點的提高能抑制大量品種同質化的問題,提高品種原始創新水平。面對新技術、新形式的挑戰,需要不斷發展和完善DNA指紋技術。

3.3 SNP技術在玉米區域試驗中的應用展望

由于SSR只采用了40個位點進行檢測,對相似品種的遺傳背景掃描標記密度較低,每個位點占比2.50%,不能精確評估相似品種間的遺傳關系。SNP作為新一代DNA指紋技術,與其他遺傳標記相比,SNP具有以下幾個突出的優勢：一是在基因組中標記密度更高,分布也更均勻,候選位點多；二是SNP通常為二態位點,數據統計容易,不同來源數據易實現整合和共享,而且試驗流程易于自動化；三是單個位點基因分型成本較低；四是具有高通量樣品和高通量位點檢測的優勢。隨著技術的不斷發展,SNP基因分型成本越來越低,各種SNP基因分型平臺已廣泛應用于遺傳研究和分子標記輔助育種中,包括基于芯片的多位點SNP檢測,單SNP基因分型和測序。SNP芯片具有高密度的位點,能更精準地評估相似品種間的遺傳背景,適用于區域試驗參試組合的特異性篩查。目前多種作物已開發不同通量的SNP芯片[16-21],我國已開發出200K、90K、60K、55K、3 072、384等不同通量的玉米SNP芯片。建議加快SNP芯片鑒定技術在各農作物品種區域試驗中的應用研究,為區域試驗品種真實性和特異性檢測提供更有效的技術方案。