牦牛MDHⅡ基因克隆表達及脂代謝候選基因關聯性分析

陳露露,王 會,王吉坤,柴志欣,王嘉博,陳智華,信金偉,姬秋梅,鐘金城

(1.青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省、教育部重點實驗室,西南民族大學,四川 成都 610041；2.省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室,西藏 拉薩 850009)

牦牛(Bosgrunniens)主要生活在青藏高原,具有“高原之舟”的美譽,較其他畜種,其繁殖和生產性能低下,但它能夠很好地適應高原氣候,如稀薄的空氣、低溫、強烈的紫外線輻射等惡劣環境,被認為是研究哺乳動物高原適應性的良好模型[1-2]。同時,它也能充分利用高原地區天然草地為人們提供優質健康的食品,如牦牛奶、牦牛肉[3]。類烏齊牦牛肉質較其他牦牛品種肉質更為鮮美,而肉質的重要決定因素之一是肌內脂肪[4-5]。在動物體內,脂肪形成、脂肪分解和脂肪酸轉運導致肌內脂肪沉積,脂肪沉積量同時也受脂肪細胞和肌肉細胞比例的影響[6-7]。通常,成年牛肌肉內脂肪貯藏庫的大小取決于甘油三酸酯的合成和降解之間的平衡,而肌內脂肪的沉積速率不僅取決于肌內脂肪細胞的數量和內在活性,還取決于肌肉生長速率和其他器官的代謝活性[8-9]。

關于牛脂代謝分子機制的研究,學者發現雷帕霉素復合物1基因(TORC1)和雷帕霉素復合物2基因(TORC2)是牛肌內脂肪形成的調節劑,且TORC2是脂肪形成的正調節劑[10-11]；線粒體Sirtuin 4基因(SIRT4)可以在營養豐富的條件下抑制脂肪酸氧化并促進脂質合成代謝,該基因敲低可能會影響E2F轉錄因子1基因(E2F1)、干擾素調節因子4基因(IRF4)和增強子結合蛋白β基因(CEBPβ)等轉錄因子調節秦川牛脂肪細胞分化的能力[12]；飼糧能量水平升高能夠使牦牛皮下脂肪中參與脂肪分解的酶活性顯著降低[13]；使用具有高含量的濃縮物的飲食,可能會增加肌內脂肪在牛肉的沉積[14-16]。Liu等[17]發現脂肪酸結合蛋白2基因(FABP2)、脂肪酸結合蛋白3基因(FABP3)、多配體受體簇36基因(CD36)和脂蛋白脂肪酶基因(LPL)參與脂肪酸轉運；肉堿棕櫚酰轉移酶-1B基因(CPT1B)、細胞色素P450 4A22基因(CYP4A22)、固醇載體蛋白2基因(SCP2)和酰基輔酶A氧化酶1基因(ACOX1)參與脂肪酸氧化；載脂蛋白A1基因(APOA1)、硬脂酰輔酶A去飽和酶基因(SCD5)和基質金屬蛋白酶1基因(MMP1)分別參與脂質轉運、脂肪生成和脂肪細胞分化。在奶牛中,脂類代謝對于維持適當的生殖功能至關重要,而產后早期,脂代謝會受到負能量平衡的影響,這歸因于脂肪儲備的調動增加,以釋放牛奶生產所需的能量[18-19]。

蘋果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase, MDH)根據分布不同而有不同的命名,分布在動物體內質網的為細胞質蘋果酸脫氫酶(Cytoplasmic malate dehydrogenase, MDHⅠ),分布在動物體線粒體的為線粒體蘋果酸脫氫酶(Mitochondrial malate dehydrogenase,MDHⅡ)[20]。MDHⅠ屬于親水性的穩定蛋白；MDHⅡ能夠在三羧酸(TCA)循環中催化蘋果酸和草酰乙酸,在線粒體基質的氧化還原控制過程中起重要作用,參與調節TCA循環[21-23]。此外,MDHⅡ活性與線粒體內膜上的蘋果酸/草酰乙酸交換密切相關；在線粒體中甘氨酸氧化期間產生的NADH,在過氧化物酶體中將羥基丙酮酸還原為甘油酸消耗[24]。青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省、教育部重點實驗室前期對牦牛MDHⅠ基因進行組織表達分析,發現其在臀脂上表達量顯著高于心臟、肝臟、肺臟等組織,推測該基因參與牦牛脂代謝調控[21],而MDHⅡ基因脂代謝研究在牦牛上未見報道。本次試驗首次克隆了牦牛MDHⅡ基因,結合組織表達譜與脂代謝候選基因相關性分析,揭示該基因與脂代謝候選基因關系,為進一步研究高原動物脂代謝機制提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 組織樣采集

于西藏自治區昌都市類烏齊縣,選取4 個年齡段(0.5,2.5,4.5,7.5歲),每個年齡段各3 頭健康的類烏齊牦牛,用DEPC水沖洗采集到的心臟、肝臟、肺臟、臀肌和臀脂組織,隨后用錫箔紙包裝并迅速置于液氮中保存備用。

1.2 牦牛MDHⅡ基因克隆及表達

1.2.1 總RNA提取及反轉錄 用TRIzol法提取類烏齊牦牛心臟、肝臟、肺臟、臀肌和臀脂組織的總RNA,其濃度用紫外分光光度計檢測,純度用瓊脂糖凝膠電泳檢測,分裝標記后置于-80 ℃的超低溫冰箱保存備用。

根據TaKaRa公司的反轉錄試劑盒說明書,將總RNA反轉錄合成cDNA,分裝標記后置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 引物設計及擴增 根據GenBank上野牦牛MDHⅡmRNA序列(XM_005892826.2),用Primer Premier 5.0設計引物并擴增牦牛MDHⅡ基因的CDS區；引物序列為F：5′-TGTGGAGGTCGTTG GAGT-3′,R：5′-CCTCCTCAACGAAGCAAA-3′,由成都擎科生物科技有限公司合成。

PCR反應體系(25 μL)： ddH2O 9.5 μL、上游引物1 μL(10 pmol/μL)、下游引物1 μL(10 pmol/μL)、cDNA模板1 μL(200～600 ng/μL)、Taq Green PCR Master Mix 12.50 μL(0.625 U)。

PCR擴增條件：預變性2 min(95 ℃)；變性30 s(95 ℃),退火30 s(53.9 ℃),延伸1 min 30 s(72 ℃),33次循環；終延伸5 min(72 ℃)；產物保存(4 ℃)。

1.2.3 膠純化及菌落培養 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物、DNA純化試劑盒(TianGen公司)進行純化膠回收,然后連接到pMD19-T載體(TaKaRa公司)上,經過16 ℃過夜連接后轉化到DH5α感受態細胞(大腸桿菌)中,涂布器涂于含Amp+的LB固體培養基上,37 ℃倒置培養10～12 h。將篩選出的陽性克隆置于含Amp+的LB液體培養基(7 mL)中,37 ℃振蕩培養10～12 h。

1.2.4 菌液擴增及目的基因測序 菌液振蕩培養后進行PCR鑒定(PCR擴增體系及條件與引物擴增相同),最后利用質粒提取盒(TianGen公司)提取質粒,交由成都擎科生物科技有限公司進行測序鑒定。

1.2.5 組織表達譜分析 用克隆得到目的片段設計實時熒光定量特異性引物。該引物序列為F：5′-AGCCGCTTTCGCTTCTT-3′,R：5′-CAGCCCTTCAGG CAATCT-3′；內參基因(GADPH)引物序列為F：5′-CCACGAGAAGTATAACAACACC-3′,R：5′-GTCATA AGTCCCTCCACGAT-3′。

實時熒光定量反應體系(10 μL)：5 μL TB Green Premix Ex TaqTMⅡ、上下游引物各0.4 μL、無菌去離子水3.2 μL、cDNA模板1.0 μL。

定量程序：預變性30 s(95 ℃)；變性5 s(95 ℃),退火30 s(55 ℃),延伸30 s(72 ℃),39 個循環。

目的基因的表達量用2-ΔΔCT法計算,內參基因(GAPDH)對樣本定量結果進行處理,結果用平均值±標準差(Mean±s)表示；顯著性分析選擇One-way ANOVA和t-檢驗。

1.2.6 生物信息學分析 對克隆得到的牦牛MDHⅡ基因序列進行生物信息學分析[21]。

1.3 脂代謝關聯性分析

表1 脂代謝候選基因引物序列Tab.1 Lipid metabolism candidate gene primer sequences

根據GenBank上公布的普通牛脂代謝候選基因,隨機選取12 個基因[25](表1),根據GenBank上公布的普通牛的序列(表1),利用Primer Premier 5.0設計實時熒光定量特異性引物,檢驗其特異性并設計溫度梯度尋找最佳退火溫度(表1),根據12 頭牦牛的臀肌和臀脂組織的表達量,分析MDHⅡ基因與脂代謝相關基因的關聯性。反應體系、定量程序與計算方法同上；選擇One-way ANOVA和t-檢驗進行顯著性分析,利用皮爾森系數法分析相關性。

2 結果與分析

2.1 牦牛MDHⅡ基因的克隆及表達

2.1.1 牦牛MDHⅡ基因PCR擴增結果 經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,PCR擴增產物條帶單一,且大小與目的片段大小一致(圖1),MDHⅡ基因DNA序列長為1 196 bp。

M.Marker D2000；1.擴增電泳條；2.菌液PCR電泳條帶。M.Marker D2000；1.Amplification electrophoresis band；2.Bacterial fluid PCR strip.

對克隆所得牦牛MDHⅡ基因序列(MN592795)進行開放性閱讀框分析(ORF Finder 在線程序),結果顯示，牦牛MDHⅡ基因CDS區長1 017 bp,編碼338 個氨基酸。

2.1.2 相似性、系統進化樹分析 利用DNAStar軟件中的MegAlign對牦牛MDHⅡ基因與其他物種進行相似性比較。結果(表2)顯示,牦牛MDHⅡ基因與普通牛(XM_005225008.3)、野豬(NM_001244153.1)的相似性最高,分別是83.3%和72.0%；其次是家貓(NM_001278853.1)、黑猩猩(XM_001156205.4)、獼猴(XM_015133288.2)、小家鼠(NM_008617.2)和人(NM_001282403.2),分別為69.0%,68.7%,68.5%,64.9%和60.8%；相似性較低的是原雞(XM_415765.6)、青鱂(XM_004077775.4)、非洲爪蛙(NM_001006693.2)和果蠅(NM_142439.3),分別為58.4%,56.7%,55.1%和 53.0%。

通過MEGA 5.2構建系統進化樹,顯示牦牛與普通牛親緣性最近；其次為野豬和家貓,與果蠅親緣性最遠(圖2)。

表2 牦牛與11個物種MDHⅡ基因的序列同源性比對Tab.2 Sequence homology alignment of yak and 11 species MDHⅡ genes

圖2 牦牛MDHⅡ基因核苷酸序列系統進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of nucleotide sequence of yak MDHⅡ gene

2.1.3 組織表達分析 組織表達分析結果顯示,MDHⅡ基因在牦牛各年齡段中,心臟和肺臟的表達水平顯著高于臀肌和臀脂組織,且隨著年齡的增長,其在各組織中的表達水平逐漸下降,每個年齡段各組織的表達趨勢基本一致(圖3)。MDHⅡ基因在牦牛的心臟和肺臟組織中表達水平較高,在臀肌中最低；在心臟中的表達水平顯著高于肝臟、臀肌和臀脂組織的表達水平,在肺臟中的表達水平顯著高于臀肌和臀脂組織的表達水平(圖4)。

A. 0.5歲；B. 2.5歲；C. 4.5歲；D. 7.5歲。相同字母表示不具有顯著性差異(P>0.05),不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。圖4同。A. 0.5 years；B. 2.5 years；C. 4.5 years；D. 7.5 years.The same letters indicate no significant difference (P>0.05), and different letters indicate significant difference (P<0.05).The same as Fig.4.

圖4 牦牛MDHⅡ基因的mRNA組織表達分析Fig.4 mRNA expression analysis of yak MDHⅡ gene

2.2 牦牛MDHⅡ基因與脂代謝相關基因的相關性分析

2.2.1 脂代謝候選基因組織表達 由圖5可知,選取的12 個脂代謝候選基因中,除FABP2和VLDLR基因外,其余10 個基因在臀脂中的表達量均高于臀肌。

2.2.2 脂代謝候選基因與MDHⅡ基因相關性分析 在臀肌組織中,脂代謝候選基因的表達量與MDHⅡ基因沒有相關性；在臀脂組織中,MDHⅡ基因表達量與CPT1呈顯著負相關(表3)。

圖5 牦牛脂代謝候選基因的mRNA組織表達分析Fig.5 mRNA tissue expression analysis of yak lipid metabolism candidate genes

3 討論與結論

MDH具有氧化還原性,參與三羧酸循環和乙醛酸循環,廣泛分布在動物體各個組織中,控制著動物的呼吸代謝。有研究發現蜜蜂中MDH有3個區帶,分別為MDHⅠ、MDHⅡ和MDHⅢ[26]；雞的MDH基因5′側翼區235 bp處的SNP位點可作為影響其生長性狀的主效基因[27]；MDH基因的SNPs(T253C)可作為控制京海黃雞脂肪性狀的主效基因[28]；豬背膘外層脂肪中MDH活性會影響肉用性狀的選育[29]。近年來,MDHⅡ基因在醫學上也被廣泛研究,其被鑒定為新的嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤易感基因；兒童的嚴重神經學臨床表現也與該基因的功能喪失有關[30-31]。本試驗對牦牛MDHⅡ基因進行了克隆表達分析,分析其與脂代謝候選基因的相關性,為該基因在肌內脂肪代謝相關研究提供參考資料。

表3 脂代謝候選基因與MDHⅡ基因在牦牛臀肌和臀脂組織中表達量相關性分析Tab.3 Correlation analysis between the expression of lipid metabolism-related genes and MDHⅡgene in yak gluteal muscle and gluteal fat tissue

注：*表示具有顯著相關性(P<0.05)。

Note：*indicate significant correlation(P<0.05).

本試驗成功克隆牦牛MDHⅡ基因,全長序列為1 196 bp,CDS區序列為1 017 bp,編碼338 個氨基酸。系統進化樹分析得到該基因進化上相對不保守,說明MDHⅡ為適應環境變化在不同物種上的遺傳特性隨之變化。線粒體是機體進行有氧呼吸氧化磷酸化的場所,是機體的“供熱站”。圍繞線粒體開展不同物種高原適應性的研究也成為研究者關注的熱點之一。Torroni等[32]發現高海拔地區人群與低海拔地區人群相比具有50%以上的特異性mtDNA,推測mtDNA變異可能是影響生物高原適應性的重要因素之一。另有研究顯示,牦牛心肌和骨骼肌中的線粒體抗氧化能力隨著海拔的升高而增強,得到牦牛線粒體參與了牦牛的高原適應性機制的結果[33]。牦牛為適應高原環境,肺臟質量為其體質量的1.1%～1.7%,且肺泡數目多,體積小,單位面積內的肺血管數目較多,心臟的質量占其體質量的0.5%～0.8%[34]。在本次研究中發現牦牛MDHⅡ基因主要分布在線粒體內,且在心臟和肺臟的表達量高于其他組織,推測該基因可能與牦牛的低氧適應性機制有關。

研究表明,MDH基因編碼的氧化還原酶參與機體內部調節和肌肉、脂肪組織的能量代謝,但關于該基因參與脂代謝調節在牦牛上的研究還未見報道[35]。本試驗組織表達分析結果顯示,MDHⅡ基因在牦牛各年齡段(除0.5歲)組織中表達趨勢相對一致；隨著年齡增長,各組織的表達量呈下降趨勢。可能是幼年時,機體各組織和器官處于生長發育階段,導致MDHⅡ表達量較高,且期間脂肪生長速率要高于肌肉生長速率,肌肉生長處于相對停滯狀態,故牦牛0.5歲時,臀脂的表達量要高于其他年齡段,但臀肌的表達量沒有顯著變化,也可能是由于試驗誤差導致的結果,但總體看來牦牛臀脂的表達量要高于臀肌。

關于脂代謝候選基因研究顯示,過氧化物酶體增殖物激活受體亞型β/δ(PPARβ/δ)通過調節VLDLR水平影響血清甘油三酸酯水平；VLDL-VLDLR信號增加會加重肥胖中的脂肪組織炎癥和胰島素抵抗[36-37]。ACACA的多態性與豬、奶牛、羊的脂肪沉積密切相關,能夠作為其遺傳選育的分子的標記[38-39]。在脂肪細胞中,脂蛋白脂酶(LPL)是影響三酰基甘油分解甘油和脂肪酸速率的控制酶[40]。肉雞中的LPL活性隨日齡的增加而增加,該基因的多態性可作為肉牛生長性狀的分子標記[41]。Han等[42]發現在非反芻細胞中,裂解激活蛋白(SCAP)能夠促進SREBP1的核轉位和FASN基因轉錄的激活,從而促進牛乳腺上皮細胞中的脂滴形成。本試驗通過對脂代謝候選基因與牦牛MDHⅡ基因在臀肌和臀脂中的表達水平進行皮爾森系數分析,得到該基因與脂代謝候選基因肉堿棕櫚酰轉移酶-1(CPT1)的表達水平顯著相關,與其他脂代謝候選基因的表達水平無顯著相關性,推測可能是因為不同基因在同一組織中有不同的表達水平,亦可能MDHⅡ基因本身與其他候選基因沒有相關性。Keung等[43]研究表明,抑制CPT1表達會增加了體內碳水化合物的利用,同時可降低脂肪酸的利用；宋銘琪等[44]研究指出CPT1可能參與大口黑鱸機體脂肪的分解代謝；梁計峻等[45]研究認為CPT1A可能在山羊肌內脂肪沉積過程中具有重要調控作用。同時,MDH在脂肪合成中有重要作用,其能夠催化動物體內蘋果酸轉化為丙酮酸并產生NADPH,因此MDHⅡ基因能夠作為豬的脂代謝候選基因[46-47]。綜上所述,MDHⅡ基因可能參與牦牛脂代謝過程,但具體作用分子機制和功能需要進一步試驗驗證。

本試驗首次克隆了牦牛MDHⅡ基因,序列全長為1 196 bp,CDS區全長為1 017 bp,編碼338 個氨基酸,在心臟上表達量高,且在脂肪組織中具有較高表達量；與脂代謝候選基因CPT1具有顯著相關性,推測該基因可能參與牦牛脂代謝過程,為今后進一步研究牦牛質代謝機制提供了參考資料。