四川省稻田土壤的抗生素抗性基因多樣性研究

何 燕，朱 冬，王 東，劉 燕，彭 超，黃麗萍，彭正松，4，路 璐*

（1.西南野生動(dòng)植物保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637002；2.西華師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川南充 637009；3.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085；4.西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，四川 西昌 615000）

抗生素自20世紀(jì)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，為人類傳染病的防治[1]、畜牧養(yǎng)殖中飼料轉(zhuǎn)化率的提高[2]以及農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害的防治[3]做出了重要貢獻(xiàn)。農(nóng)業(yè)領(lǐng)域抗生素的濫用問(wèn)題已經(jīng)引起了世界各國(guó)的關(guān)注，中國(guó)抗生素使用量約占世界一半，其中52%用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[4]。抗生素的大量使用導(dǎo)致抗生素抗性細(xì)菌（Antibiotics re?sistance bacteria，ARB）和抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）的富集和傳播，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[5]。同時(shí)，絕大多數(shù)ARGs位于微生物細(xì)胞中可移動(dòng)遺傳元件（Mobile genetic ele?ments，MGES，如質(zhì)粒和整合子等）上，使耐藥性細(xì)菌能迅速蔓延，ARGs在不同細(xì)菌種群間的基因水平轉(zhuǎn)移（Horizontal gene transfer，HGT），更是加劇了ARGs在不同環(huán)境介質(zhì)中的傳播，且存在ARGs通過(guò)食物鏈向人體遷移的潛在風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。

農(nóng)田土壤是ARGs的重要儲(chǔ)存庫(kù)，也是抗生素環(huán)境效應(yīng)形成的主要場(chǎng)所[8]。農(nóng)田土壤中的ARGs主要包括天然土壤環(huán)境中ARGs背景值，以及通過(guò)有機(jī)肥施用、污水灌溉等農(nóng)業(yè)活動(dòng)進(jìn)入土壤環(huán)境的ARGs[9-10]。不同種類的ARGs在農(nóng)田土壤中被檢出，其中包括四環(huán)素類、多重耐藥性類、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、磺胺類、氯霉素類、萬(wàn)古霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類-林可酰胺類-鏈陽(yáng)性菌素B類（MLSB類）等[11-12]。不同類型的農(nóng)田土壤由于其生物[11]和理化性質(zhì)[13-15]、受人為干擾程度和類型[14]的差異，可能導(dǎo)致了農(nóng)田土壤ARGs組成特征的差異。如前期研究表明農(nóng)田土壤的ARGs分布特征與土壤pH、總有機(jī)質(zhì)、總氮、總磷、重金屬等理化性質(zhì)都有顯著相關(guān)性[13-15]。微生物群落多樣性作為重要的生物學(xué)指標(biāo)，也是ARGs分布差異的主要驅(qū)動(dòng)因子[11]。在農(nóng)田土壤中，很多研究表明施用有機(jī)肥顯著提高了土壤中ARGs的豐度和多樣性，同時(shí)也可能導(dǎo)致耐藥性致病菌的傳播[16-17]。因此，作為受人為干擾較為頻繁的土壤環(huán)境，在大尺度上或區(qū)域水平探究農(nóng)田土壤ARGs的分布規(guī)律及其驅(qū)動(dòng)機(jī)制，既可以揭示不同區(qū)域的ARGs的污染特征，也為ARGs的產(chǎn)生途徑研究提供數(shù)據(jù)支撐。

新的ARGs不斷被發(fā)現(xiàn)[18]，針對(duì)ARGs的引物越來(lái)越多，這也要求有更高通量、更快速和靈敏的檢測(cè)技術(shù)來(lái)探究環(huán)境樣品ARGs的多樣性。近年來(lái)，美國(guó)Wafergen公司開(kāi)發(fā)的高通量熒光定量PCR（Highthroughput qPCR，HT-qPCR）技術(shù)為快速定量檢測(cè)大量樣品提供了新途徑，其可同時(shí)進(jìn)行5 184個(gè)qPCR反應(yīng)[19]。該技術(shù)已應(yīng)用于環(huán)境中水體[20]、污泥[21]、土壤[17]、污水處理廠[22]和植物[23]等各類樣品ARGs的檢測(cè)，為本研究提供了技術(shù)支撐。

以往大多數(shù)的稻田土壤ARGs的污染現(xiàn)狀研究主要集中在我國(guó)南方的水稻種植區(qū)，如江西和湖南等[15，24]，中國(guó)西部稻田種植區(qū)的土壤ARGs分布特征仍不清楚。四川盆地屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，降水豐富，為我國(guó)主要的水稻種植區(qū)之一[25]。因此，本文采用HT-qPCR技術(shù)，對(duì)四川省7個(gè)不同區(qū)域的稻田土壤ARGs的豐度和多樣性進(jìn)行研究。旨在揭示四川省稻田土壤的ARGs分布特征和規(guī)律；探究四川稻田土壤的潛在“指示ARGs”及影響ARGs分布格局的主導(dǎo)環(huán)境因子。為全面了解四川省稻田土壤的ARGs污染現(xiàn)狀提供重要數(shù)據(jù)，并為農(nóng)田土壤的潛在生物污染評(píng)估和制定ARGs防控措施提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)信息

于2016年11月在四川省的7個(gè)水稻種植區(qū)域采集了土壤樣品（圖1），分別是巴中市（BZ）、廣安市（GA）、南充市（NC）、成都市（CD）、綿陽(yáng)市（MY）、攀枝花市（PZH）、西昌市（XC）。7個(gè)采樣區(qū)域均長(zhǎng)期施用農(nóng)家肥，其中包括發(fā)酵的農(nóng)家糞肥、沼氣廢液或附近養(yǎng)殖場(chǎng)的發(fā)酵糞肥等。每個(gè)采樣點(diǎn)采用網(wǎng)格布點(diǎn)法，在50 m×50 m范圍內(nèi)，分別采集3份表層土壤（0～10 cm），清除植物根系、石礫等，過(guò)2 mm孔徑的不銹鋼篩。將過(guò)篩后的土壤取部分自然風(fēng)干后過(guò)0.90 mm孔徑篩，用于土壤理化性質(zhì)分析。另取一部分過(guò)2 mm孔徑篩的土壤裝入塑封袋中置于-20℃的冰箱以備后續(xù)分子生物學(xué)分析。

圖1 稻田土采樣分布情況Figure 1 Soil sampling site locations of the 7 paddy soils

1.2 土壤基本理化性質(zhì)的測(cè)定

采用稱重法測(cè)定稻田土含水量，采用pH計(jì)（PHS-3C，上海，中國(guó)）測(cè)量土壤pH值[m（土）∶V（水）=1∶2.5]，采用全自動(dòng)間斷化學(xué)分析儀（CleverChem 200+，Hamburg，德國(guó)）測(cè)定土壤總氮、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮。土壤總有機(jī)質(zhì)由TOC分析儀（Elementar-TOC&Water Analysis，德國(guó)）測(cè)定。本試驗(yàn)采用懸浮液培養(yǎng)法，通過(guò)測(cè)定短期內(nèi)土壤硝化速率來(lái)估算土壤的硝化潛勢(shì)[26]。

1.3 土壤總DNA提取與熒光定量PCR分析

總DNA提取使用FastDNA spin kit for soil（MP Biomedicals，美國(guó)）試劑盒，每個(gè)土壤3個(gè)重復(fù)。DNA濃度用NanoDrop分光光度計(jì)（NanoDrop 2000，德國(guó)）測(cè)定。提取的DNA置于-20℃的冰箱，待用后續(xù)分析。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增分析使用SYBR?Permix ExTaqTM試劑盒（Tli RNaseH Plus）在 CFX96 Optical Real-time Detection PCR System熒光定量?jī)x（Bio-Rad Laboratories Inc.，美國(guó)）上進(jìn)行。測(cè)定16SrRNA基因，氨氧化古菌（Ammonia-oxidizing archaea，AOA）和氨氧化細(xì)菌（Ammonia-oxidizing bacteria，AOB）的amoA基因的豐度[27]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線采用含有16SrRNA基因、AOA的amoA和AOB的amoA基因質(zhì)粒，質(zhì)粒標(biāo)線按10倍梯度稀釋，標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)粒濃度的變化范圍為103～109copies·μL-1。定量PCR的反應(yīng)體系為 20μL，包括 1μL DNA模板、10μL SYBR?Premix EX TaqTM（Til RNaseH Plus）、正反向引物各0.1μL和8.8μL的滅菌蒸餾水。陰性對(duì)照用滅菌雙蒸水代替樣品。

1.4 高通量熒光定量PCR（HT-qPCR）

使用Wafergen SmartChip Real-time PCR System熒光定量的反應(yīng)平臺(tái)（Warfergen Inc.，美國(guó)；Takara Bio，日本）對(duì)296個(gè)引物對(duì)進(jìn)行高通量熒光定量PCR分析。其中，296個(gè)引物包括了283個(gè)ARGs（針對(duì)9類主要的抗生素：氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、氯霉素類、MLSB類、磺胺類、四環(huán)素類、萬(wàn)古霉素類、多重耐藥性類和其他類）、8個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因、4個(gè)整合酶-整合子基因和1個(gè)16SrRNA基因[21，28]。為保證每個(gè)樣品DNA的初始濃度一致，使用Qubit 3.0熒光計(jì)（Thermo?Fisher Scientific，USA）測(cè)定所有樣品DNA的濃度，然后稀釋至相同濃度。每個(gè)PCR體系的引物、樣品DNA、酶等由SmartChip多樣品納米分配器（Wafer?Gen Inc.，美國(guó)）分別加樣到SmartChip芯片孔（Takara Bio，日本）中，SmartChip芯片共有5 184孔，可同時(shí)進(jìn)行qPCR反應(yīng)。隨后將SmartChip芯片置于Smart Chip Cycler高通量qPCR儀（Takara Bio，日本）進(jìn)行反應(yīng)。HT-qPCR反應(yīng)體系為100 nL，各試劑終濃度為：1×Light Cycler 480 SYBR GreenⅠ Master Mix、1μg·μL-1BSA、5 ng·μL-1DNA模板、1 μmol·L-1前置和后置引物，無(wú)核酸酶雙蒸水。擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)[28]。所有qPCR均進(jìn)行了兩次以上的技術(shù)重復(fù)，以滅菌水代替樣品作為陰性對(duì)照。根據(jù)Wafer?gen SmartChip Real-time PCR System的檢測(cè)限和靈敏度，對(duì)數(shù)據(jù)的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：（1）擴(kuò)增效率在80%～120%；（2）循環(huán)臨界值（Cycle Threshold，Ct）小于31；（3）3個(gè)技術(shù)重復(fù)至少2個(gè)得到擴(kuò)增為有效擴(kuò)增。

基因相對(duì)拷貝數(shù)和絕對(duì)豐度分別用公式（1）和公式（2）進(jìn)行計(jì)算。根據(jù)Looft等[19]的方法，高通量熒光定量PCR基因的相對(duì)拷貝數(shù)計(jì)算公式為（1）；根據(jù)Zhu等[28]的研究，絕對(duì)豐度的計(jì)算公式為公式（2）。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS20進(jìn)行方差分析（ANOVA），P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用R軟件和Geph（i0.9.2）軟件進(jìn)行ARGs網(wǎng)絡(luò)分析[29-30]。ARGs和環(huán)境因子相關(guān)性冗余分析（Redundancy analysis，RDA）采用Canoco 4.5軟件。用Origin 8.5制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同稻田土壤中ARGs的類型多樣性

如圖2所示，7個(gè)稻田土中，一共檢出166種不同的ARGs，6種轉(zhuǎn)座子基因，3種整合子基因。平均每個(gè)土壤中檢出71種ARGs，在CD土壤檢出的ARGs個(gè)數(shù)最多，為84個(gè)，PZH土壤最少，為56個(gè)。7個(gè)稻田土中檢出的MEGs的數(shù)量范圍為4～7種，在MY土壤檢出的MEGs個(gè)數(shù)最多。對(duì)7個(gè)稻田土ARGs的檢出個(gè)數(shù)進(jìn)行方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，稻田土壤樣品間有差異。MY、PZH和XC土壤的ARGs個(gè)數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05），但都顯著高于其余土壤（P＜0.05）。7個(gè)稻田土中檢出的166種ARGs亞型中，主要的ARGs種類為多重耐藥性類（22.89%）、β-內(nèi)酰胺類（16.87%）、氨基糖苷類（16.27%）、四環(huán)素類（13.86%）、MLSB類（13.85%）、萬(wàn)古霉素類（7.23%）、磺胺類（2.41%）、氯霉素類（1.20%）和其他類（5.42%）9類（圖2b）。根據(jù)不同引物所對(duì)應(yīng)的耐藥機(jī)制，7個(gè)稻田土中抗生素抗性機(jī)制主要為抗生素失活（42.17%）、抗生素外排泵（32.53%）和細(xì)胞核糖體保護(hù)（22.29%）（圖2c）。

2.2 不同稻田土中ARGs和MEGs的豐度比較分析

7個(gè)稻田土中ARGs的基因拷貝數(shù)，即絕對(duì)豐度，范圍為9.55×108（GA）～2.83×1010（NC）copies·g-1（干質(zhì)量）（圖3a）。NC土壤ARGs的絕對(duì)豐度極顯著高于MY和NC土壤（P＜0.01）。CD和GA土壤ARGs的絕對(duì)豐度極顯著低于MY、NC和XC土壤（P＜0.01）（圖3a）。7個(gè)稻田土中豐度最高的ARGs類型均為多重耐藥類，占總豐度的 26.26%～77.57%，約 3.15×108～7.49×109copies·g-（1干質(zhì)量），以NC土壤中豐度最高（圖3b）；其次為 MLSB類，占總豐度的1.74%～22.60%，約1.55×108～4.79×109copies·g-（1干質(zhì)量）（圖3b）。氨基糖苷類抗性基因在NC土壤中豐度最高，而且顯著高于其他土壤（P＜0.05），是其他6個(gè)土壤的4.65～189.43倍。四環(huán)素類抗性基因的絕對(duì)豐度以NC土壤為最高，達(dá)2.46×109copies·g-（1干質(zhì)量）。萬(wàn)古霉素類抗性基因在7個(gè)土壤中都有檢出，豐度約為8.86×107～4.32×109copies g-（1干質(zhì)量），以NC土壤中最高。7個(gè)稻田土中MGEs的總拷貝數(shù)檢測(cè)到的范圍為1.14×109～2.29×1010copies·g-（1干質(zhì)量），NC土壤豐度顯著高于其他樣品（P＜0.05）。MGEs和ARGs的總基因拷貝數(shù)呈極顯著正相關(guān)（R=0.979，P＜0.001）（圖3a）。

圖2 7個(gè)稻田土中的ARGs個(gè)數(shù)、各類ARGs的檢出個(gè)數(shù)和各類抗生素抗性機(jī)制比例Figure 2 The detected numbers of ARGs in the 7 paddy soils,the resistance genes detected in all samples were classified based on the antibiotic to which they confer resistance，and the percentage of the resistance mechanism

為評(píng)估ARGs在整個(gè)細(xì)菌群落中的相對(duì)豐度及傳播風(fēng)險(xiǎn)，將ARGs和MGEs豐度歸一化到單個(gè)細(xì)菌水平，平均到每個(gè)細(xì)胞中的ARGs和MGEs的基因拷貝數(shù)（圖3c），即相對(duì)豐度。7個(gè)稻田土中ARGs的相對(duì)豐度范圍為0.006～0.025 copies·cell-1，平均每個(gè)細(xì)胞有0.01個(gè)ARGs。NC土壤ARGs的相對(duì)豐度顯著高于其他6個(gè)土壤（P＜0.01）。7個(gè)稻田土的主導(dǎo)ARGs的種類為多重耐藥類（49.26%）、MLSB類（11.29%）和β-內(nèi)酰胺類（10.87%），占總相對(duì)豐度的71.42%（圖3d）。不同種類ARGs相對(duì)豐度的差異性分析表明，XC土壤的β-內(nèi)酰胺類和多重耐藥性類抗性基因的相對(duì)豐度最高，都顯著高于其他土壤（P＜0.05）；GA和BZ土壤的四環(huán)素類抗性基因相對(duì)豐度顯著高于其他土壤（P＜0.05）；NC土壤的氯霉素類抗性基因相對(duì)豐度最高，而PZH土壤的磺胺類抗性基因豐度最高。7個(gè)土壤樣品中，平均每個(gè)細(xì)胞中有0.008±0.004個(gè)MGEs。其中，XC土壤MGEs的相對(duì)豐度最高，為0.02 copies·cell-1，顯著高于其他樣品（P＜0.05）。ARGs和MGEs的總相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)（R=0.882，P=0.009）（圖3c）。

2.3 不同土壤中ARGs和MEGs的組成比較分析

基于稻田土ARGs的相對(duì)豐度的熱圖（圖4）表明，不同土壤樣品中的ARGs組成有所差異，每種土壤都有其獨(dú)有的ARGs類群（圖4中B～G分組模塊）。7個(gè)土壤共有的主導(dǎo)ARGs類群分別為oprJ、oprD、acrA-04（多重耐藥性類）、vanC-03（萬(wàn)古霉素類）、tetG-01（四環(huán)素類）、aacC（氨基糖苷類）、mphA-01（MLSB類）、blaCTX-M-04（β-內(nèi)酰胺類）、pncA（其他類）。每個(gè)樣品的主導(dǎo)ARGs均不同。如PZH土壤的主導(dǎo) ARGs為 aacC、acrA-04、acrA-05、mphA-01和oprD，占其總相對(duì)豐度的34.99%，其中acrA-04基因豐度是其他土壤中該基因的1.48～19.45倍。CD土壤的主導(dǎo)ARGs是tet（37）、ampC_bla DHA、fabK和blaC?TX-M-03，其中，tet（37）的相對(duì)豐度比XC土壤高出2 843.39倍。各樣品中都檢出其獨(dú)有的ARGs，在XC土壤中檢出16種，而且其中的mexF（多重耐藥性類）和fox5（β-內(nèi)酰胺類）為XC土壤的主導(dǎo)ARGs，豐度占其總相對(duì)豐度的82.21%。7個(gè)稻田土中均檢出MGEs，如 intI-1（clinic）、tnpA-04、intI-1LC、tnpA-02等。其中，intI-1（clinic）在7個(gè)樣品中都被檢出，相對(duì)豐度范圍為0.003～0.011 copies·cell-1。

圖3 7個(gè)稻田土中的各類ARGs絕對(duì)豐度與相對(duì)豐度及其平均絕對(duì)豐度與平均相對(duì)豐度比例Figure 3 The absolute copy number and the normalized copy number of ARGs and the averaged absolute copy number proportion and the averaged normalized copy number proportion of different ARGs types in the 7 paddy soils

圖4 基于稻田土ARGs相對(duì)豐度的熱圖Figure 4 Heatmap based on the normalized copy number of ARGs profiles of the 7 paddy soils

2.4 7個(gè)稻田土壤中ARGs和MGEs的網(wǎng)絡(luò)分析

基于ARGs和MEGs的相對(duì)豐度，分析不同ARGs和MEGs在7個(gè)稻田土中相對(duì)豐度變化的相關(guān)性（相關(guān)性系數(shù)r范圍0.5～1），將顯著相關(guān)（P＜0.05）的基因呈現(xiàn)于網(wǎng)絡(luò)圖中（圖5）。相連線的兩個(gè)基因?yàn)轱@著正相關(guān)，線條越粗，表明相關(guān)性越強(qiáng)。圖中的圓圈大小表示模塊中所占比例大小，根據(jù)ARGs之間相關(guān)性強(qiáng)弱和相關(guān)的ARGs個(gè)數(shù)決定。使用Gephi-0.9.2軟件計(jì)算與分析，該網(wǎng)絡(luò)分析的模塊系數(shù)為0.513，該相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析可分為4個(gè)模塊。網(wǎng)絡(luò)圖共有64個(gè)節(jié)點(diǎn)和312條邊（圖5）。模塊Ⅰ、模塊Ⅱ、模塊Ⅲ、模塊Ⅳ分別占 28.12%、26.56%、26.56%、18.75%。blaC?MY2-02（β-內(nèi)酰胺類）、tetL-02（四環(huán)素類）、oleC（MLSB類）、aadA-01（氨基糖苷類）分別為模塊Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的樞紐中心。

2.5 土壤生物理化性質(zhì)與ARGs相對(duì)豐度的冗余分析

利用7個(gè)稻田土中相對(duì)豐度排在前50的ARGs和8種環(huán)境因子做冗余分析（圖6）。可見(jiàn)，7個(gè)樣品分散于4個(gè)象限中，如CD和PZH土壤ARGs的多樣性類似，均聚類在第2象限，而B(niǎo)Z和GA土壤的ARGs聚類在第3象限。影響土壤ARGs在不同地區(qū)分布格局的第1排序軸和第2排序軸特征值分別為42.6%、28.4%，可以解釋ARGs差異總方差值的71.0%。冗余分析表明，總氮解釋了32.0%ARGs多樣性在不同土壤中的差異，對(duì)ARGs分布格局的影響達(dá)極顯著水平（P=0.006）（表1）。此外，土壤的硝態(tài)氮、pH、銨態(tài)氮、總有機(jī)質(zhì)以及氨氧化微生物的豐度均不同程度地解釋了ARGs多樣性在不同土壤中的差異，但并無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。

圖5 稻田土ARGs和MGEs網(wǎng)絡(luò)分析圖Figure 5 Network analysis depicting co-occurrence patterns among ARGs and MGEs of the 7 paddy soils

圖6 基于相對(duì)豐度前50的ARGs和環(huán)境因子的冗余分析Figure 6 Redundancy discrimination analysis（RDA）of paddy soil based on the normalized copy number of ARGs（top 50）and soil environmental factors

3 討論

稻田作為一種典型的人為土壤，其生物理化性質(zhì)受到自然與人為農(nóng)業(yè)耕種因素的雙重影響，在區(qū)域水平揭示稻田土壤ARGs多樣性的分布格局，為理解農(nóng)業(yè)活動(dòng)對(duì)稻田生態(tài)系統(tǒng)中ARGs多樣性的影響，以及為優(yōu)化耕種和施肥方式提供依據(jù)。

四川省7個(gè)不同區(qū)域的稻田土ARGs的豐度和多樣性有所差異。Tang等[15]在中國(guó)南方4個(gè)不同水稻試驗(yàn)田中也發(fā)現(xiàn)，不同樣地的ARGs豐度和組成有顯著差異，且ARGs豐度和組成受土壤理化性質(zhì)、施肥頻率的影響。土壤環(huán)境的差異會(huì)造成土壤微生物地理分布的不同[31]，很多研究發(fā)現(xiàn)ARGs的多樣性與微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著相關(guān)性[21，32]，前期對(duì)這7個(gè)土壤的微生物指標(biāo)研究發(fā)現(xiàn)其氨氧化微生物群落有顯著差異[33]，因此，推測(cè)微生物群落結(jié)構(gòu)的差異可能導(dǎo)致這7個(gè)稻田土ARGs多樣性地域分布差異。7個(gè)稻田土中ARGs的檢出個(gè)數(shù)和豐度最高的均為多重耐藥性類，與很多農(nóng)田土壤中的研究結(jié)果類似[11，34]。多重耐藥性類抗性基因的傳播對(duì)人類和動(dòng)物的抗感染治療是極大的威脅[35]，一旦這些ARGs轉(zhuǎn)移至致病菌中，則可能通過(guò)食物鏈或者直接感染進(jìn)入人體，進(jìn)而對(duì)當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的健康產(chǎn)生潛在威脅。如Chen等[36]研究表明施肥的土壤及其地上種植的植物葉際都檢測(cè)到多種ARGs，且在植物葉際上大量檢出在肥料中獨(dú)有的ARGs。該研究表明，ARGs可能以土壤為載體遷移至植物或蔬菜葉際，進(jìn)而進(jìn)入食物鏈影響人類健康。因此，加強(qiáng)監(jiān)管與教育，促進(jìn)農(nóng)用抗生素合理應(yīng)用顯得更為必要，尤其是對(duì)各類廣譜抗菌藥物的使用管制。萬(wàn)古霉素是人類抵抗細(xì)菌感染的“最后一道防線”之一[37]，然而，隨著在人類醫(yī)療中的廣泛使用，萬(wàn)古霉素已在很多環(huán)境中富集，如河口沉積物[28]、土壤[34]、水體[21]。7個(gè)稻田土中萬(wàn)古霉素類抗性基因的檢出表明該稻田生態(tài)系統(tǒng)可能受到人為污染源的影響。雖然這些ARGs可能僅存在于微生物中，實(shí)際不表現(xiàn)出抗性或在外界抗生素壓力下才能表達(dá)[38]，但對(duì)農(nóng)田土壤中ARGs多樣性的深入分析，能對(duì)ARGs潛在的農(nóng)業(yè)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)做科學(xué)評(píng)估，同時(shí)為未來(lái)進(jìn)一步檢測(cè)農(nóng)田土壤抗生素抗性指明了方向。此外，這些ARGs可能會(huì)隨著土壤微生物通過(guò)孔隙水、雨水、灌溉水等載體，沖刷至周?chē)暮恿魉w、池塘、井水或沉積物中[39]，導(dǎo)致更大尺度的垂直或水平的ARGs基因轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，因此，農(nóng)田土壤ARGs的富集所造成的潛在環(huán)境影響應(yīng)高度重視。

表1 基于相對(duì)豐度前50的ARGs和環(huán)境因子的冗余分析所得的Eigen、F和P值Table 1 Eigen values，F(xiàn) values，P values obtained from normalized copy number of ARGs（top50）and redundancy analysis of soil environmental factors

7個(gè)稻田土中檢出的ARGs基本涵蓋了主要的已知抗生素類型，如氨基糖苷類（aac和aad等基因）、四環(huán)素類（tet基因）、β-內(nèi)酰胺類（blaCTX-M和blaCMY等基因）等，這些ARGs類型在以往的土壤環(huán)境研究中也有檢出[17，40]。其中，7個(gè)稻田土中的主導(dǎo)ARGs之一aacC基因是在污水、廢水和動(dòng)物糞便中最頻繁檢出的一類ARGs[41]，表明其可能是隨施肥或灌溉等途徑進(jìn)入土壤環(huán)境。編碼外排泵類四環(huán)素抗性基因tetG-01在7個(gè)土壤中有較高豐度，tetG基因在豬糞、土壤、沼氣殘?jiān)U水等樣品中都被檢出[13，42]，說(shuō)明該四環(huán)素類抗性基因在環(huán)境中普遍存在，tetG基因隨著糞肥施用和廢水灌溉等農(nóng)業(yè)活動(dòng)進(jìn)入農(nóng)田土壤，并可能在農(nóng)田土壤中富集。同時(shí)，抗生素的殘留也是農(nóng)田土壤ARGs富集的主要原因，如Zhu等[17]在我國(guó)多處大型養(yǎng)殖場(chǎng)的糞肥和周邊土壤中發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素的殘留量可達(dá)15.2 mg·kg-1和0.78 mg·kg-1。且Gullberg等[43]發(fā)現(xiàn)即使是非常低濃度的抗生素濃度，也能對(duì)環(huán)境中的ARB和ARGs產(chǎn)生選擇壓力。通過(guò)施肥進(jìn)入農(nóng)田土壤環(huán)境的抗生素，與環(huán)境微生物產(chǎn)生互作效應(yīng)，對(duì)環(huán)境中的土著微生物產(chǎn)生抗生素的選擇壓力和耐藥基因的選擇[44]，本研究中的7個(gè)水稻種植點(diǎn)均施用有機(jī)肥，包括養(yǎng)殖場(chǎng)中發(fā)酵的糞肥，因此，不同土壤中的主導(dǎo)ARGs類型可能也受有機(jī)肥中殘留抗生素的影響。如施用了當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場(chǎng)糞肥的XC土壤中的mexF基因（多重耐藥類）比在其他6個(gè)土壤中顯著富集，這與黃福義等[45]的結(jié)果吻合，其發(fā)現(xiàn)施用了豬糞的水稻土壤中mexF基因的豐度相對(duì)于對(duì)照組土壤增加1 791倍。多重耐藥類抗性基因acrA-04在PZH土壤中的顯著富集（高達(dá)19.45倍），有研究表明acrA基因在養(yǎng)殖場(chǎng)的廢水中[46]以及施用雞糞的土壤中[11]也都有很高的檢出率和豐度。因此，耕種、施肥、灌溉等農(nóng)田管理措施，可能已造成了土壤中ARGs的富集，且四川省內(nèi)不同地區(qū)的土壤具有明顯的空間分布差異，未來(lái)進(jìn)一步測(cè)定土壤抗生素殘留情況及檢測(cè)土壤抗性水平，對(duì)更深入地研究不同農(nóng)業(yè)耕種區(qū)的ARGs污染狀況有重要參考意義。

網(wǎng)絡(luò)分析顯示59種ARGs和5種MGEs的相對(duì)豐度之間存在關(guān)聯(lián)（P＜0.05）。分析表明，每個(gè)模塊的中心都可作為此模塊中其他基因的“指示ARG”，模塊中心的ARGs的微生物宿主可能與同一模塊中的其他ARGs的宿主相同[47]。例如，blaCMY2-02是模塊Ⅰ的中心，可作為在strB（氨基糖苷類）、blaOXY（β-內(nèi)酰胺類）、aadA90-01（氨基糖苷類）等基因的“指示ARG”（圖5）。利用網(wǎng)絡(luò)分析探索“指示ARGs”，可以快速估算環(huán)境樣品中的ARGs污染狀況。此外，許多研究表明ARGs在微生物間的傳播和擴(kuò)散與MEGs密切相關(guān)[17，48]，ARGs與轉(zhuǎn)座子、整合子的顯著正相關(guān)表明MEGs可能促進(jìn)了ARGs在稻田土壤中的遷移和傳播。本研究所有樣品中均檢測(cè)到整合子intI1（clin?ic），該基因被用作判定環(huán)境是否受人為源污染的標(biāo)志基因[49]。研究發(fā)現(xiàn)醫(yī)療和環(huán)境菌株中的intI1與很多ARGs的基因盒相關(guān)，如氨基糖苷類抗性基因aadA、四環(huán)素類抗性基因tetG等都在intIl整合子基因盒中發(fā)現(xiàn)[50]。網(wǎng)絡(luò)分析表明7個(gè)稻田土中的tetG、acrA-01、mexE等ARGs與intI1（clinic）、intI-1LC等整合子基因呈顯著正相關(guān)（圖5），進(jìn)一步表明稻田土壤中intI1整合子-基因盒系統(tǒng)對(duì)ARGs的傳播起著重要作用，且基因盒可能含有多樣性很高的ARGs。此外，基于ARGs和MEGs的相對(duì)豐度的網(wǎng)絡(luò)分析可知，四環(huán)素類抗性基因tetL-2與轉(zhuǎn)座子tnpA基因顯著正相關(guān)（P＜0.05）（圖5），這些結(jié)果表明該基因可能存在于轉(zhuǎn)座子上。如Chopra等[51]研究發(fā)現(xiàn)攜帶有tet基因的轉(zhuǎn)座子將tet基因轉(zhuǎn)座至不同的共軛質(zhì)粒中。因此，ARGs的水平轉(zhuǎn)移作為ARGs的重要傳播方式應(yīng)得到重視，并應(yīng)加強(qiáng)農(nóng)田土壤中ARGs的水平轉(zhuǎn)移機(jī)制研究。

冗余分析表明，ARGs的組成和分布受多種理化性質(zhì)的影響。總氮解釋了32.0%ARGs組成在不同土壤中的差異，對(duì)ARGs分布格局的影響達(dá)極顯著水平（P=0.006）（表1）。這一結(jié)果與Cheng等[13]和成衛(wèi)孝[52]在農(nóng)田土壤中的研究結(jié)果一致。總氮是表征土壤肥力的重要指標(biāo)之一，農(nóng)田土壤中總氮的含量通常與施肥量呈正相關(guān)[53]。該結(jié)果說(shuō)明施肥可能是這7個(gè)稻田土壤中ARGs的重要來(lái)源。因此，有必要針對(duì)性地制定科學(xué)合理的施肥制度，探究堆肥過(guò)程中耐藥微生物和ARGs的產(chǎn)生與去除，以減少農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的生物污染。然而，土壤中ARGs的多樣性受各環(huán)境因子的選擇壓力、基因水平轉(zhuǎn)移、微生物增殖和死亡等多重因素的影響[17，48，54]，僅依靠土壤理化性質(zhì)可能難以精準(zhǔn)預(yù)測(cè)或評(píng)估ARGs的來(lái)源和污染現(xiàn)狀，因此，未來(lái)探究農(nóng)田環(huán)境ARGs的污染機(jī)理和控制對(duì)策尤為重要。

4 結(jié)論

（1）稻田土是ARGs的一個(gè)重要存儲(chǔ)庫(kù)，ARGs的水平轉(zhuǎn)移可能促進(jìn)抗性基因的遷移和富集，進(jìn)而加劇農(nóng)田土壤的ARGs污染。

（2）基于ARGs相關(guān)性的網(wǎng)絡(luò)分析所識(shí)別的“指示ARGs”可作為評(píng)估四川稻田土ARGs污染水平的潛在方法。

（3）不同地區(qū)的稻田土壤ARGs組成各異，造成其差異的自然環(huán)境和人為因素，以及ARGs在農(nóng)田環(huán)境中的傳播機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

（4）施肥可能是稻田土壤ARGs的重要來(lái)源，未來(lái)需加強(qiáng)對(duì)農(nóng)田肥料，尤其是糞肥的ARGs污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。