低溫嗜堿性纖維素降解細(xì)菌的分離與鑒定

孟建宇，丁雪敏

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用與環(huán)境微生物研究室，內(nèi)蒙古呼和浩特010011）

經(jīng)濟(jì)和人口的快速增長(zhǎng)使得環(huán)境污染及能源危機(jī)等問(wèn)題日益顯著，因而尋找這些問(wèn)題的解決方法尤為重要。纖維素是自然界中最豐富的可再生資源之一 （林燕萍，2018；Patyshakuliyeva 等，2016），利用纖維素酶將自然界中的纖維素物質(zhì)降解后可重新利用，其對(duì)于緩解能源危機(jī)及環(huán)境污染問(wèn)題等有重大意義。中高溫纖維素降解菌的降解活性在寒冷環(huán)境中有很大程度上的降低，而低溫纖維素降解菌所產(chǎn)生的纖維素酶具有獨(dú)特的適應(yīng)機(jī)制，使反應(yīng)在低溫環(huán)境中仍然進(jìn)行，無(wú)需加熱和冷卻等額外條件 （李春艷等，2015；王玢等,2003）。因此利用低溫纖維素降解菌可達(dá)到生產(chǎn)成本低廉、節(jié)約能源的目的，從而使纖維素的降解在低溫環(huán)境中呈現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì) （張麗珉等，2018；董碩等，2011；王世杰等，2011），故尋找高效的低溫纖維素降解菌是目前研究的熱點(diǎn)。

在降解纖維素的微生物中，真菌降解纖維素的能力較為突出，但因生長(zhǎng)比較緩慢、不耐熱、不耐堿性等限制了其工業(yè)化的發(fā)展 （ Ruijssenaars等，2004）。但細(xì)菌擁有來(lái)源廣、種類(lèi)多、生長(zhǎng)快、適應(yīng)極端環(huán)境能力強(qiáng)等特點(diǎn)，使工業(yè)化生產(chǎn)易實(shí)現(xiàn)，故顯現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用前景，堿性纖維素酶耐堿性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性好、發(fā)酵周期短（Li 等，2012），在廢水處理、紡織、造紙和洗滌等行業(yè)有較高的應(yīng)用價(jià)值。而國(guó)內(nèi)外對(duì)堿性低溫纖維素降解細(xì)菌的研究報(bào)道相對(duì)較少（李強(qiáng)等，2012）。

內(nèi)蒙古西部地區(qū)土壤鹽堿化較普遍，秋冬季節(jié)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)且年平均氣溫偏低，是低溫嗜堿性微生物生長(zhǎng)的適宜環(huán)境。本研究在4 ℃條件下，對(duì)內(nèi)蒙古西部地區(qū)土壤中具有降解纖維素能力的細(xì)菌進(jìn)行篩選，以挖掘高效的低溫纖維素嗜堿性纖維素降解菌，為解決環(huán)境污染及能源危機(jī)等問(wèn)題提供一種可持續(xù)發(fā)展的生物措施。

1 材料與方法

1.1 樣品 樣品采自內(nèi)蒙古西部地區(qū)鹽堿地的表層土壤，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基配方 富集培養(yǎng)基： 秸稈末 5 g，KH2PO42 g，MgSO40.5 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1000 mL，pH 9.0。

分離培養(yǎng)基：CMC-Na 5 g，酵母提取物 2 g，KH2PO42 g，MgSO40.5 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1000 mL，pH 9.0。

1.3 菌株的分離純化 將采回的土樣充分混合后加入以秸稈為唯一碳源的pH 為9 的富集培養(yǎng)液中，4 ℃下富集培養(yǎng)10 d，轉(zhuǎn)接新鮮培養(yǎng)基再次富集，轉(zhuǎn)接3 次。取10 mL 富集液加入含90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，置于 120 r/min 搖床中振蕩1 h，充分混勻，然后將富集后的樣品溶液稀釋成10-2～10-5稀釋度的溶液，涂布于分離培養(yǎng)基，4 ℃培養(yǎng)10 d。挑取不同形態(tài)、顏色的單菌落進(jìn)行純化，獲得純培養(yǎng)物。

1.4 菌株的鑒定 對(duì)分離的菌株進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取（胡曉紅等，2008）后，用細(xì)菌通用引物對(duì)27F 和1492R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后送上海生工測(cè)序公司測(cè)序。將測(cè)序的結(jié)果利用RDP 在線程序Classifier 及NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast-n程序進(jìn)行相似性比對(duì)分析。

1.5 酶活性測(cè)定 用DNS 法測(cè)定酶活性。在1 mL粗酶液中加入 2 mL 1%（W/V） 的 CMC-Na 緩沖液，于50 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，然后加入2.5 mL DNS 試劑，于沸水浴中煮沸5 min，冷卻后定容25 mL，用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm 下的吸光值。

酶活力定義： 在50 ℃的反應(yīng)條件下，1 min 內(nèi)催化底物生成1 μmoL 葡萄糖所需的酶量為1 IU/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫堿性纖維素降解細(xì)菌的分離篩選 以CMC-Na 為唯一碳源，從內(nèi)蒙古西部地區(qū)偏堿性土壤樣品中篩選嗜堿低溫纖維素降解細(xì)菌，共獲得5株具纖維素降解能力的菌株：X2（3）、X6-1、X4（1）、X7-1 和X3-1，其菌落形態(tài)特征如表1 所示。

表1 菌落形態(tài)特征

2.2 16 S rDNA 序列同源性分析 本研究采用細(xì)菌16S rDNA 通用引物對(duì)所提取的純菌菌株X2（3）、X6-1、X4（1）、X7-1 和 X3-1 的 DNA 進(jìn)行了16S rDNA PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可見(jiàn)，PCR 產(chǎn)物片段清晰且單一，均約為1.5 kb，與預(yù)期目的片段長(zhǎng)度接近。

圖1 16S rDNA PCR 電泳檢測(cè)圖

對(duì)測(cè)序所得序列，根據(jù)測(cè)序圖譜峰型截取合適長(zhǎng)度后，利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast-n 程序?qū)ζ溥M(jìn)行16S rDNA 序列分析以確定菌株的種屬關(guān)系。通過(guò)結(jié)合細(xì)菌形態(tài)特征和利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast-n 程序?qū)y(cè)序獲得的部分長(zhǎng)度16S rDNA序列（821 bp）進(jìn)行了同源性分析（表2），結(jié)果表明菌株 X2（3）與 Paenibacillus 最同源，同源性達(dá)到99%，推測(cè)其為類(lèi)芽孢桿菌屬（Paenibacillus）的一個(gè)種。菌株 X6-1 與 Sphingobacterium daejeonense 最同源，同源性達(dá)到100%，推測(cè)其為鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）的一個(gè)種。菌株X4（1）與Microbacterium 最同源，同源性達(dá)到 99%，推測(cè)其為微桿菌屬（Microbacterium）的一個(gè)種。菌株 X3-1 與 Pseudomonas 最同源，同源性達(dá)到98%，推測(cè)其為假單胞菌屬（Pseudomonas）的一個(gè)種。菌株 X7-1 經(jīng)分析為 Uncultured bacterium clone，在Blast-n 分析中未找到同源菌。

表2 菌種鑒定和Blast-n 同源性分析結(jié)果

2.3 酶活測(cè)定 對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行酶活測(cè)定，相對(duì)酶活性為 24～29 IU/mL，菌株 X2（3）酶活最高，為28.60 IU/mL，菌株X7-1 酶活最低，為23.72 IU/mL（表3）。

表3 菌株酶活測(cè)定

3 討論

目前纖維素酶產(chǎn)生菌的研究主要集中在真菌，且研究較多的是木霉屬、曲霉屬、真菌屬等產(chǎn)生的酸性纖維素酶（劉森林等，2008），而對(duì)細(xì)菌降解纖維素的研究較少（崔秀秀等，2016；Brown 等，2014），尤其是可產(chǎn)生堿性纖維素酶的低溫細(xì)菌。本文對(duì)內(nèi)蒙古西部地區(qū)堿性土壤中的低溫嗜堿性纖維素降解菌進(jìn)行分離，最終得到五株具有較高酶活性的低溫嗜堿性纖維素降解菌。通過(guò)16S rDNA 序列同源性分析顯示菌株X2（3）屬于類(lèi)芽孢桿菌屬（Paenibacillus），酶活性為 28.60 IU/mL；菌株 X6-1屬于鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium），酶活性為24.65 U/mL；菌株 X4（1）屬于微桿菌屬（Microbacterium），酶活性為 26.02 IU/mL 菌；菌株 X3-1 屬于假單胞菌屬 （Pseudomonas），酶活性為 24.41 IU/mL；菌株X7-1 在Blast-n 中未找到其同源菌，推測(cè)可能為該菌株可能屬于新的菌屬，酶活性為23.72 IU/mL。得到的五株低溫嗜堿性纖維素降解菌的酶活性均高于已報(bào)道文獻(xiàn)的酶活性（何海燕等，2019；陳雅娟等，2014；迪麗拜爾·托乎提等，2013；劉森林等，2005）。今后可利用液體發(fā)酵進(jìn)一步研究五株低溫嗜堿性纖維素降解菌發(fā)酵的最適條件、發(fā)酵的最適底物、酶作用的最適條件等，為開(kāi)發(fā)應(yīng)用高效的低溫纖維素嗜堿性纖維素降解菌奠定基礎(chǔ)。