纖維蛋白顯像劑131I-YSSCREKA肽的制備及對早期血栓定位的研究

劉 敏，申鎬源，馬 歡，龐小溪，霍 焱，趙光宇，孫宏偉，王榮福，張春麗

北京大學第一醫院 核醫學科，北京 100034

血栓栓塞性疾病，如心肌埂塞、腦中風和肺栓塞等在全球的病死率居高不下。約一半的深靜脈血栓(deep venous thrombosis, DVT)形成后會脫落，是導致肺動脈血栓栓塞的主要原因。DVT年發病率約0.1%，最常發生于小腿和大腿深靜脈內，但也可發生在上肢深靜脈、內臟靜脈甚至腔靜脈中[1]。早期準確定位血栓位置可預防血栓脫落造成栓塞，對DVT患者有重要的臨床意義。

靜脈血栓核素顯像分為非特異(如99Tcm-MAA)和特異(如抗纖維蛋白抗體、抗血小板抗體、RGD肽等)放射性核素顯像。由于抗體在血液循環時間較長、在肺內的放射性聚積時間較長，因此臨床應用受限。而小肽段的顯像劑可從血液循環中很快被清除。CREKA肽由Simberg等[2]通過噬菌體展示技術篩選獲得，可特異性結合纖維蛋白-纖維連接蛋白復合物，用于血栓形成早期、腫瘤微環境、動脈粥樣硬化及心肌缺血再灌注研究[3-4]，含CREKA肽的納米顆粒被報道用于急性血栓的核磁共振-超聲-光聲多模態成像研究中[5]。

本研究使用放射性核素131I標記含CREKA的八肽YSSCREKA，對其在動物模型中的早期血栓顯像及體內生物分布進行研究。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

YSSCREKA八肽，上海吉爾生化有限公司；Sephadex G10柱顆粒，Pharmacia Biotech公司；牛血清白蛋白(蛋白質含量>98%)，中國醫學科學院血液研究所；Na131I，北京原子高科股份有限公司；氯胺-T(化學純，純度98%)，上海國藥集團化學試劑有限公司；正丁醇、無水乙醇、氨水(14.8 mol/L)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)及其他化學試劑均為分析純，北京化學試劑公司。

RM905型放射性活度儀, 中國計量科學研究院; FT-163γ井型計數器，北京核儀器廠；FA1104電子天平,精度0.1 mg，上海精科天平公司; 微量加樣器(10 μL、200 μL、1 mL)、5415D臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；MDF-U52V型-80 ℃超低溫冰箱，日本SANYO公司；電熱恒溫水浴鍋，上海醫療器械三廠；GZ-1多角振蕩器，北京冰箱電機廠。

SD大鼠(200～300 g)、新西蘭家兔(2～3 kg)，北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 131I-YSSCREKA的制備

1.2.1131I-YSSCREKA的標記及純化 YSSCREKA多肽序列由上海吉爾生化有限公司通過Apex396全自動高通量多肽合成儀采用固相合成法合成，在CREKA肽的半胱氨酸端加酪氨酸及D型絲氨酸，形成Y-(D)Ser-(D)Ser-CREKA八肽，以便被131I碘化標記。用氯胺-T法進行131I標記。將200 μg YSSCREKA八肽溶于100 μL pH=7.4 的0.5 mol/L磷酸鹽(PB)緩沖液中備用，在EP管中依次加入0.5 mol/L PB緩沖液50 μL、YSSCREKA八肽溶液25 μL、Na131I 溶液34.8～88.8 MBq(0.94～2.4 mCi) 50 μL、氯胺-T溶液, 使氯胺-T在混合液中的質量濃度為0.9 g/L，總反應體積不超過200 μL。將混合液放入振蕩器，室溫振蕩5 min。將混合液通過經10%牛血清白蛋白飽和的Sephadex G10柱分離純化，用pH=7.4的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，用EP管收集淋洗液，每管0.5 mL，依次測定各EP管的放射性計數，第一個計數高峰為131I-YSSCREKA。

1.2.2131I-YSSCREKA標記率、放射化學純度及體外穩定性的測定 在混合物過Sephadex G10柱前及過柱后第一個計數高峰EP管中取少量待測液體，通過放射性紙層析法分別得到標記率及放射化學純度。將純化后的131I-YSSCREKA溶液置于室溫(25 ℃)中，分別在0、1、3、6、24、48、72 h后通過放射性紙層析法測定其穩定性。展開劑為正丁醇、無水乙醇和0.5 mol/L氨水，體積比為5∶1∶2，131I-YSSCREKA的比移值(Rf)為0～0.1。

1.3 動物模型的建立

1.3.1SD大鼠靜脈血栓模型的建立 SPF級SD大鼠25只，性別不限，5～10周齡，體重200～300 g，在屏障環境內用3%(質量分數，下同)戊巴比妥鈉以50 mg/kg經腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術臺，備皮，打開腹腔，在腹腔后壁分離下腔靜脈，在其外壁敷1.5 cm×0.1 cm質量分數為 25% FeCl3溶液的濾紙條約15 min，促進血管內壁血栓形成。取出濾紙，關閉腹腔，飼養2 d，期間飲用質量分數為0.5% NaI的水，封閉甲狀腺及胃腸道粘膜。

1.3.2兔靜脈血栓模型的建立 普通級新西蘭家兔3只，性別不限，體重2～3 kg，用3%戊巴比妥鈉以1 mL/kg經耳緣靜脈注入麻醉，仰臥位固定于手術臺，備皮，打開腹腔，在右腎下極以遠約3 cm處尋找下腔靜脈，在其內置入長約1.5 cm的單股螺旋銅絲，縫合血管，止血，觀察下腔靜脈血液回流通暢后關閉腹腔，飼養2 d，期間飲用質量分數為0.5% NaI的水，封閉甲狀腺及胃腸道粘膜。

1.4 SD大鼠體內生物分布

取下腔靜脈血栓造模后2 d的SD大鼠25只，隨機分為5組，每組5只。前4組經尾靜脈分別注射131I-YSSCREKA 3.7 MBq，分別于注射后6、12、20、48 h眼球取血100 μL后斷頸處死大鼠。第5組為阻斷組，在注射131I-YSSCREKA前30 min注射YSSCREKA肽50 μg，使無放射性的YSSCREKA肽與血栓位點結合，于20 h眼球取血100 μL后斷頸處死大鼠。剝離血栓、取其主要臟器組織(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃壁、小腸壁、膀胱、股骨、肌肉、血液)并稱重。γ井型計數儀測定各器官或組織的放射性計數。結果經過標準源校正，計算每克組織百分注射劑量率(%ID/g)，并計算血栓與各組織器官的放射性比值，并對20 h未阻斷組與20 h阻斷組血栓對131I-YSSCREKA的攝取及血栓/血比值進行兩獨立樣本t檢驗。

1.5 活體動物單光子發射計算機斷層(SPECT)顯像

兔血栓造模后2 d經耳緣靜脈注入14.8 kBq/g131I-YSSCREKA，分別在注射后1、2、6、12、20、48 h行全身靜態SPECT顯像。SPECT儀采用高能通用準直器，采集時設置能峰360 keV，窗寬20%，1 000 k計數，矩陣128×128。在注射后20 h的血栓部位影像中勾畫血栓處感興趣區(region of interest, ROI)，在血栓上方的下腔靜脈選取與血栓等面積的ROI，計算血栓部位與血液的放射性比值(T/B)。

2 結果與討論

2.1 131I-YSSCREKA的標記率、放射化學純度及穩定性

標記率、放射化學純度及穩定性實驗均重復3次。對標記產物采用放射性紙層析法測得的標記率為(77.2±1.1)%，經Sephadex G10柱純化后放射化學純度為(90.0±3.1)%。放射性比活度為(643.4±232.1) MBq/mg，放射性活度濃度為(29.3±11.3) MBq/mL。0～72 h131I-YSSCREKA在室溫下磷酸鹽溶液中的放射化學純度示于圖1，前24 h放射化學純度大于80%，72 h放射化學純度大于75%，說明131I-YSSCREKA在體外穩定性較高。

圖1 131I-YSSCREKA的體外穩定性Fig.1 In vitro stability of 131I-YSSCREKA

2.2 SD大鼠體內生物分布

對每組下腔靜脈血栓SD大鼠分別測量每克組織百分注射劑量率，計算血栓與其他組織放射性比值，生物分布結果列于表1。由表1可以看出：放射性示蹤劑在血液中6 h時的放射性攝取為(0.44±0.05)%ID/g，12 h時為(0.12±0.04)%ID/g，血液清除較快；示蹤劑在腎、膀胱積聚較高，在肝積聚低，表明131I-YSSCREKA主要經泌尿系統排泄。示蹤劑在胃積聚較高，尤其12 h可達(0.74±0.19)%ID/g，但隨時間延長放射性攝取逐漸下降。注射后不同時間血栓與各組織的放射性比值列于表2。由表2可以看出：血栓/肌肉維持較高的放射性比值，血栓/血液放射性比值隨時間延長逐漸增高，在20 h時其比值達1.9，與48 h比值相近，但48 h血栓內131I-YSSCREKA放射性攝取僅為(0.04±0.01)%ID/g，在SPECT上與注射后20 h相比更加難以探測信號。與20 h未阻斷組相比，20 h阻斷組血栓對131I-YSSCREKA的攝取降低，t檢驗P=0.03；血栓/血放射性攝取比值從1.90降至0.85，t檢驗P<0.001。

表1 131I-YSSCREKA在SD大鼠體內的生物分布Table 1 Biodistribution of 131I-YSSCREKA in SD rat with vein thrombus

注：n=5

表2 在大鼠血栓模型中注射131I-YSSCREKA后不同時間血栓與各組織的放射性比值(T/NT)Table 2 T/NT of 131I-YSSCREKA in SD rat with vein thrombus at different time post injection

注：n=5

2.3 家兔血栓SPECT顯像

箭頭所指為血栓部位圖2 家兔血栓模型注射131I-YSSCREKA 20 h后的SPECT顯像Fig.2 SPECT images of rabbit with vein thrombus after 20 h 131I-YSSCREKA injection

131I-YSSCREKA肽在3只兔中均于注射后20 h左右血栓部位出現放射性聚集，至48 h時逐漸減淡至消失，與YSSCREKA肽在體內被酶降解有關。圖2顯示家兔注射顯像劑131I-YSSCREKA后20 h的SPECT圖像，箭頭所指為血栓部位。20 h的血栓/血的T/NT值為1.36。

3 結 論

131I-YSSCREKA多肽在室溫下進行標記反應，標記率為(77.2±1.1)%(n=3)，放射化學純度為(90.0±3.1)%(n=3)，體外穩定性較好。131I-YSSCREKA對血栓有較高的選擇性，心、肝、脾、肺、骨、肌肉等組織對其攝取低，131I-YSSCREKA有望成為一種新型早期血栓顯像劑。