MARCH2在胃癌中的異常表達及臨床意義

夏 丹

胃癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，其在東亞國家尤其是在中國發病率最高。胃癌是國內第三大腫瘤相關性死亡的主要原因[1]。MARCH2(membrane associated RING-CH protein 2)是MARCH家族的成員之一，含RING結構域，作為E3泛素連接酶，可調節細胞運輸、DNA修復和信號轉導等多種細胞活動。近年有文獻報道MARCH2與病毒免疫逃逸蛋白密切相關，HIV-1感染時MARCH2表達水平升高[2]。MARCH2的泛素化底物包括Dsh[3]、CFTR[4]、β2AR[5]和DLG1[6]，其在腫瘤中的作用鮮有報道。本文應用免疫組化SP法檢測MARCH2在125例胃癌組織中的表達，并探討MARCH2表達與胃癌臨床病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2000年1月～2016年12月山東醫學高等專科學校附屬醫院和北京大學第三醫院存檔的原發性胃癌手術切除標本125例及正常胃黏膜組織標本30例。其中男性96例，女性29例，中位年齡60歲(33～82歲)，所有患者術前均未行化療、放療及生物治療。病理診斷及組織學分級均由兩名病理醫師確診。所選病例臨床資料完整，其中高分化腺癌1例，中分化腺癌28例，低分化腺癌96例；TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期26例，Ⅲ期76例，Ⅳ期12例；85例有淋巴結轉移。標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片6張備用。收集患者的臨床病理資料，包括患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期(UICC/AJCC 2010)。

1.2 試劑兔抗人MARCH2多克隆抗體(美國Abcam公司)；濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋公司)、SP免疫組化超敏染色試劑盒(福州邁新公司)。

1.3 方法采用免疫組化SP法染色，抗原修復為高壓熱修復，修復液使用1 mmol/L EDTA(pH 9.0)，一抗為MARCH2(1 ∶100)，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，DAB顯色。用已知MARCH2陽性片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判定由兩位病理醫師獨立閱片綜合判斷。每張切片隨機觀察5個有代表意義的高倍視野，每個高倍視野計數150～200個細胞，蛋白表達采用免疫反應評分(immunoreactivity score, IRS)，將著色細胞數比例與著色強度相結合。按著色細胞占計數細胞百分率計分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。按著色強度計分：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕色為3分。將兩項得分結果相乘：0分為陰性(-)；1～4分為弱陽性(+)；5～8分為中等陽性()；9～12分為強陽性()。如果兩名病理醫師評分差異>3分，則該標本需重新評分。

1.5 統計學分析采用SPSS 15.0軟件進行統計學分析，組間比較采用χ2檢驗，兩變量之間的相關性采用Spearman等級相關性分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MARCH2在胃癌組織中的表達MARCH2染色主要位于腫瘤細胞胞質和(或)胞核，呈彌漫棕色顆粒狀(圖1)。125例胃癌組織中MARCH2陰性34例，弱陽性21例，中度陽性53例，強陽性17例。MARCH2在胃癌組織中的陽性率為72.8%(91/125)。30例正常胃黏膜組織中MARCH2陰性23例，弱陽性7例。MARCH2在正常胃黏膜組織中的陽性率為23.3%(7/30)。MARCH2在胃癌組織中的陽性率明顯高于正常胃黏膜組織，差異有統計學意義(P<0.01，表1)。

2.2 MARCH2表達與胃癌臨床病理特征的關系MARCH2表達與胃癌分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期密切相關(P<0.01，表2)。MARCH2表達與患者年齡、性別和腫瘤直徑無關。

圖1 MARCH2在胃癌組織中的表達，SP法：A.MARCH2陰性；B.MARCH2弱陽性；C.MARCH2中度陽性；D.MARCH2強陽性

表1 胃癌及正常胃黏膜組織中MARCH2的表達

表2 MARCH2表達與胃癌臨床病理特征的相關性

3 討論

MARCH家族是一個結構上相關聯的蛋白家族，其成員結構特點為由N端的RING-CH結構域和緊連的C端兩個或多個跨膜區組成，這種跨膜RING-CH finger蛋白具有多種生物學功能，如免疫調節、蛋白質控和膜運輸[7]。

目前MARCH家族有11個成員(MARCH-I-XI)[8]。MARCH-Ⅱ基因是Bartee課題組在2004年發現，定位于第19號染色體短臂13區2帶(19p13.2)，基因全長25 746 bp，其開放讀碼框編碼246個氨基酸，相對分子質量為2.6×104。TMHMM軟件分析和功能結構域分析顯示MARCH-Ⅱ是二次跨膜蛋白，由N端RING domain、中間的二次跨膜區和C端的PDZ domain構成。功能研究顯示，MARCH-Ⅱ能降解細胞表面受體如轉鐵蛋白受體(TfR)和共刺激分子B7.2(CD86)[7]。應用免疫熒光觀察到MARCH蛋白與內質網以及溶酶體共定位[7]。Xavier研究團隊在HEK293T細胞中證實MARCH-Ⅱ也能定位在細胞膜上，通過其PDZ motif與DLG1相互作用促進DLG1泛素化，減弱DLG1在細胞連接點的表達，影響細胞的極性[9]。Shenoy課題組證實MARCH-Ⅱ能與β2AR相互作用，β2AR拮抗劑卡維地洛能夠增強MARCH-Ⅱ與β2AR相互作用促進β2AR的內吞和溶酶體降解。MARCH-Ⅱ也能促進β2AR的泛素化，調節細胞表面的β2AR水平[5]。最近Guggino科研團隊研究發現，在囊性纖維化支氣管上皮細胞中MARCH-Ⅱ通過與CAL(CFTR相關的配體)和STX6結合泛素化并降解CFTR[4]。CFTR是質膜cAMP調節的Cl-通道，負責經上皮的鹽和液體的運輸。CFTR基因功能缺失性突變會引起致死性退行性基因遺傳病囊性纖維化(cystic fibrosis, CF)[10]。已有研究顯示，CFTR缺陷會引起自噬的減低，導致蛋白聚集體的積累、肺部炎癥和CF的發生。累積的數據顯示，CFTR在腫瘤的進展和轉移中發揮重要作用。根據腫瘤類型不同，CFTR遺傳變異可能增高或降低腫瘤發生的風險[11-13]。目前研究尚不能確定在腫瘤細胞中CFTR和自噬之間的關系，且CFTR與MARCH2在自噬中的功能關系尚不清楚。

本組先前實驗證實了MARCH2負向調控細胞自噬[14]；MARCH2過表達會損傷自噬，表現為過表達MARCH2導致LC3B-Ⅱ水平的減少和內外源性自噬性底物降解的減弱，該效應的發揮一方面牽涉PIK3CA/AKT-MTOR信號通路的活化，另一方面可能是通過與CFTR相互作用，促進其功能失活而實現的[14]。然而，MARCH2在腫瘤中的作用并不清楚。

本實驗在前期研究基礎上應用免疫組化法檢測了自噬負向調節因子MARCH2在125例胃癌中的表達并且評估了MARCH2表達與臨床病理特征的關系。本實驗發現，MARCH2在胃癌中的表達水平明顯高于正常胃黏膜組織，提示MARCH2可能參與癌癥的發生。本實驗結果亦顯示，MARCH2陽性染色更多出現在浸潤深度更深、有淋巴結轉移或更高TNM分期的胃癌組織中，提示MARCH2可能在腫瘤進展中發揮作用。這些結果提示MARCH2參與了胃癌的發生、發展，MARCH2可能成為胃癌診斷、治療和評估預后的分子靶標。