酶底物法測定水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌質量控制研究

陳明桂， 楊 虹

(1.天津天濱瑞成環境技術工程有限公司，天津 300100；2.天津市生態環境監測中心，天津 300100)

1 引言

總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌是人和溫血動物腸道中的正常寄生細菌， 是水體糞便污染的最佳指示菌， 也是水質評價的重要微生物指標之一。總大腸菌群是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，包括埃希氏菌屬、腸桿菌屬、檸檬酸菌屬、克雷伯菌屬等菌屬。糞大腸菌群又叫耐熱大腸菌群，是總大腸菌群中的一部分，主要包括埃希氏菌屬和耐熱克雷伯菌屬，其能夠更為貼切反映水體受糞便污染程度。大腸埃希氏菌又稱大腸桿菌，是總大腸菌群、糞大腸菌群的主要種類[1]。總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌常用的測定方法主要有多管發酵法、濾膜法、紙片法和酶底物法。酶底物法由于具有檢出限低、準確度高、操作方便、時效性高等優點[2]，從而得到了廣泛應用。但目前對酶底物法測定水中總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌的質量控制研究仍較少，本文將從實驗部分、實驗室要求、實驗室人員、工作菌懸液、設備、標準陽性比色盤和廢棄物處理等方面對實驗室質量控制進行研究，為檢測結果的準確性提供保障，能夠更好地服務環境保護工作。

2 實驗部分

2.1 試劑和材料

Minimal Medium ONPG-MUG培養基；硫代硫酸鈉溶液：0.10 g/mL；乙二胺四乙酸二鈉溶液：0.15 g/mL；97孔定量盤；標準陽性比色盤。

2.2 儀器和設備

高壓蒸汽滅菌器：121 ℃可調；恒溫培養箱：允許溫度偏差37 ℃±1 ℃、44.5 ℃±0.5 ℃；程控定量封口機；紫外燈：波長365～366 nm。

2.3 標準菌株

(1)金黃色葡萄球菌：26003-5a28-2(F2)，中國藥品食品檢定研究院。

(2)產氣腸桿菌：CICC10293(F2)，中國工業微生物菌種保藏管理中心。

(3)大腸埃希氏菌：44102-3a23-3(F2)，中國藥品食品檢定研究院。

2.4 樣品測定方法

根據《水質 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定 酶底物法》 (HJ 1001-2018)進行樣品采集、保存、接種、培養以及結果判讀、結果計算。總大腸菌群、大腸埃希氏菌于37 ℃±1 ℃下培養24 h，糞大腸菌群于44.5 ℃±0.5 ℃下培養24 h。每次實驗應填寫恒溫培養箱溫控記錄。

2.5 實驗室空白

每批樣品都要用無菌水進行實驗室空白測定。量取100 mL無菌水于滅菌后的三角瓶，加入2.7 g±0.5 g培養基粉末，充分混勻，完全溶解后全部倒入97孔定量盤內，趕除氣泡，程控定量封口機封口。總大腸菌群、大腸埃希氏菌于37 ℃±1 ℃下培養24 h，糞大腸菌群于44.5 ℃±0.5 ℃下培養24 h。

2.6 陰性和陽性對照

將標準儲存菌株制成300～3000個/mL的工作菌懸液，取100 mL菌懸液于滅菌后的三角瓶中，加入2.7 g±0.5 g培養基粉末，充分混勻至完全溶解后，全部倒入97孔定量盤內，以手撫平97孔定量盤背面，趕除孔內氣泡，然后用程控定量封口機封口。將封口后的97孔定量盤放入特定溫度的恒溫培養箱中培養24 h。

2.7 精密度測定

對低、中和高3種濃度的實際水樣進行測定，每個樣品平行測定6次，以驗證方法精密度。

2.8 準確度測定

對有證標準樣品進行測定，以驗證方法準確度。

3 質量控制

3.1 實驗室要求

實驗室空間安排要合理，需要配備：①準備室：進行培養基制備，需明確標示出無菌區和非無菌區；②無菌室：放置超凈工作臺，以用于接種水樣；③培養室：主要放置用于培養微生物的恒溫培養箱；④鑒定室：放置生物安全柜，用于轉移培養微生物；⑤高溫室：主要用于對廢棄物和其他器具進行高溫消毒。無菌室在使用前后都要進行清潔消毒處理，并每月對無菌室進行沉降菌測試[4]。實驗室要求通風良好、避免灰塵、溫度恒定，室內墻壁和地板要使用防透水材料，工作臺應使用光滑、防水、抗腐蝕、接縫少的材料，保持室內空氣的清潔和實驗室用具的整潔。

3.2 實驗室人員

實驗員應具有一定的專業理論知識和技能，并獲得專業考試證書；應積極參加培訓和理論知識學習，不斷提高業務技術水平并及時掌握微生物檢測新技術；定期進行方法比對及人員比對；應具有嚴謹認真的工作態度。

3.3 工作菌懸液制備

標準菌株需要從標準菌種保藏中心或其他有效認證的商業機構獲得，嚴格按照使用說明書進行復蘇，并按照《食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》(GB4789.28-2013)制備成標準儲存菌株，于-20 ℃低溫冷藏箱中保存[5]。

自-20 ℃低溫冷藏箱取出標準儲存菌株一支，將菌液全部倒入盛有50 mL適合的液體培養基中，于36.5 ℃、30 r/min水浴恒溫振蕩器中培養18 h。然后驗證菌株的純度和形態，挑取2～3個典型菌落于36.5 ℃、30 r/min水浴恒溫振蕩器中培養18 h。將培養后的菌懸液進行稀釋，以血球計數板初步計數每小格2～3個活動菌為宜，計算出菌液濃度，再根據菌液濃度稀釋至300～3000個/mL。

3.4 設備

培養總大腸菌群、大腸埃希氏菌所用恒溫培養箱應達到37 ℃±1 ℃，培養糞大腸菌群所用的培養箱應達到44.5 ℃±0.5 ℃，每天都要檢查培養箱溫度是否穩定無誤，填寫控溫使用記錄。高壓蒸汽滅菌器每次使用時應用121 ℃壓力蒸汽滅菌化學指示卡檢查是否符合滅菌條件，每季度進行一次嗜熱脂肪肝菌芽孢菌片滅菌效果評價。計量部門對上述設備每年校準一次，檢查溫度是否達到要求。實驗人員根據校準證書中的溫度偏差進行修正，并在設備正面標明修正因子。紫外線燈需定期檢測，包括對紫外線波長、強度及評價其消毒效果的物理學指標和生物學指標的檢測[6]。

3.5 標準陽性比色盤

標準陽性比色盤應置于干燥陰涼處避光存放，孔內的液體不少于其體積的2/3，否則需要重新更換。隨時觀察比色盤以防比色盤內液體顏色發生變化，影響數據準確性。無特殊情況需按其有效期提前更換。

3.6 廢棄物處理

實驗過程產生的具有潛在危險的廢棄物，需要進行高壓蒸汽滅菌，在確保微生物滅活后，液體廢棄物倒入下水道，菌株培養的廢棄物應放入標有生物危害的黃色塑料袋中，交由有資質的單位處理。對于實驗室產生的其他一般廢棄物，將其放入一般垃圾袋中即可[7]。

4 結果討論

4.1 空白對照

培養后97孔定量盤均無任何顏色變化，證明實驗室空白合格。

4.2 陰性和陽性對照

將各標準菌株制成300～3000個/mL的菌懸液，將菌懸液按方法要求接種培養，結果顯示陽性菌株呈現定量盤顏色變為黃色為陽性反應，陰性菌株呈現定量盤顏色不發生變化為陰性反應，證明陰陽性對照試驗合格。

4.3 精密度

將低、中和高3種不同濃度樣品分別對總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群進行平行測定6次，結果見表1～3。結果顯示，低、中和高濃度樣品中總大腸菌群測定的相對標準偏差分別為1.2%、1.0%和1.9%，糞大腸菌群測定的相對標準偏差分別為1.7%、2.7%和5.9%，大腸埃希氏菌測定的相對標準偏差分別為1.7%、1.4%和7.2%，均滿足要求。

4.4 準確度

總大腸菌群標準樣品QC-FD-035標準值為5200(2 300～12 000)MPN/100 mL，測定值為4279 MPN/100 mL；糞大腸菌群標準樣品QC-FD-006標準值為13 000 MPN/mL，測定值為12439 MPN/mL；大腸埃希氏標準樣品QC-FD-033標準值為3100(1000～9500) MPN/100mL，測定值為2001 MPN/100 mL，均滿足要求。

表1 總大腸菌群精密度的測定結果

表2 糞大腸菌群精密度的測定結果

表3 大腸埃希氏菌精密度的測定結果

綜上所述，采用酶底物法檢測水中的總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌，對樣品進行全程序空白對照，陰陽性對照試驗，以及對精密度和準確度進行驗證，結果都在質量控制范圍內。按照以上質量控制要求，加強管理，可獲得精確數據，滿足方法要求。酶底物法具有簡便、精準、快速、方法檢出限低等優點，使酶底物法測定總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的應用越來越廣泛， 所以，做好酶底物法測定水中總大腸的質量控制研究具有非常重要的意義。