大麻二酚的強制降解研究

楊 雨，劉超，孫武興，王曙賓

(漢義生物科技(北京)有限公司 生命科學研究院，北京 100176)

1 引言

大麻二酚(cannabidiol，CBD)，化學名為5′-甲基-4-戊基-2′-(丙-1-烯-2-基)-1′，2′，3′，4′-四氫-[1，1′-聯苯]-2，6-二醇[1]，其結構式見圖1，屬于大麻素類化合物(cannabinoids)，是大麻中的主要非成癮性活性成分。大麻二酚于1940年首次被分離得到[2]，目前已證實具有抗炎[3]，抗精神病[4]，降低體外癌癥細胞的存活率和增殖率[5～8]等多種重要藥學活性。隨著美國FDA 于2018 年6 月25 日批準GW公司的Epidiolex口服液用于年齡在2 歲及以上患者的Lennox-Gastaut綜合征和Dravet綜合征的治療[9]。CBD日漸成為制藥行業研究的熱點。藥物的強制降解實驗，是將藥物置于人為設定的比較劇烈的試驗條件下，如酸、堿、氧化、高溫、高濕和光照，考察其內在穩定性的一系列試驗。目前尚未有大麻二酚的強制降解研究報道，因此本文通過建立HPLC法測定在酸、堿、氧化、高溫、高濕和光照條件下強制降解的CBD的含量和雜質，分析其降解趨勢，反映植物中提取分離得到的CBD的內在穩定性，從而為制劑處方設計及產品包裝、儲存條件的選擇提供重要參考依據。這對于創新藥而言尤為重要。

圖1 CBD的化學結構式

2 儀器和試藥

2.1 樣品與試劑

大麻二酚(云南漢素生物科技有限公司，批號：20180801)；乙腈(美國Fisher公司，批號：190888)；甲酸(上海泰坦科技股份有限公司，批號：P1364203)；95%乙醇(上海泰坦科技股份有限公司，批號：P1464904)；濃鹽酸(北京化工廠，批號：20171218)；氫氧化鈉(天津市致遠化學試劑有限公司，批號：2019年01月027日)；過氧化氫(北京化工廠，批號：20180703)；其中乙腈為色譜級純度試劑，其他試劑均為分析純試劑，實驗用水為怡寶純凈水。

2.2 儀器

SQP型電子天平(德國賽多利斯科學儀器有限公司)；LC-16系列高效液相色譜(日本島津公司)； SHH-250SD型藥品穩定性試驗箱(重慶永生實驗儀器廠)；PRX150B型智能人工氣候箱(寧波賽福試驗儀器公司)；KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

3 方法

3.1 HPLC分析方法

建立大麻二酚HPLC分析方法，Diamonsil C18色譜柱(規格：4.6×150 mm，3 μm，廠家：迪馬科技公司)；樣品稀釋劑為95%乙醇；流動相A為0.1% 甲酸-水溶液，流動相B為0.1% 甲酸-乙腈溶液；線性梯度洗脫：0.0～5.0 min，A 90%～25%；5.0～25.0 min，A 25%～22%；25.0～35.0 min，A 22%～5%；35.0～40.0 min，A 5%；40.0～40.1 min，A 5%～90%，40.1～45.0 min，A 90%；流速為1.0 mL/min；檢測波長為220 nm；柱溫為30 ℃；進樣體積為10 μL。

3.2 方法學考察

3.2.1 專屬性

空白溶液(95%乙醇)對CBD及雜質檢測無干擾。

3.2.2 線性范圍

精密稱取60.28 mg CBD粉末至100 mL容量瓶中，加入稀釋劑超聲，使樣品完全溶解。逐級稀釋儲備液，得到各線性溶液。進HPLC分析測得峰面積，如表1所示。以CBD樣品溶度(X，μg/mL)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程：Y=331.38589X+243.09129，r=0.999。結果表明：大麻二酚在0.15～600 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

表1 線性溶液配制及峰面積測定結果列表

3.2.3 檢測限

當信噪比為3時，CBD的濃度為0.05 μg/mL。

3.2.4 定量限

當信噪比為10時，CBD的濃度為0.15 μg/mL。

3.2.5 精密度

分別精密稱定6份約30 mg CBD粉末至6個100mL容量瓶中，配制成濃度為0.3 μg/mL樣品溶液，連續進樣分析，測得CBD含量的RSD%為0.3，可見方法的精密度良好。

3.2.6 準確度

CBD作為原料藥，其準確度可根據《中國藥典》2015版第四部<9101>規定，由精密度、線性和專屬性推算出來[10]，由于該方法在0.15～600 μg/mL范圍內線性、精密度、專屬性均良好，因此推斷準確度良好。

3.3 強制降解實驗

本文選用不同濃度的酸、堿、氧化劑以及不同程度的高溫、高濕及光照對CBD進行破壞，考察CBD在固體狀態及溶液狀態(95%乙醇作為溶劑)的穩定性。

3.3.1 酸降解實驗

精密稱取33.60 mg CBD樣品至容量瓶中，加入4.0 mL乙醇溶解樣品，之后加入3.0 mL HCl(1 mol/L)，室溫放置3 h，再以NaOH(1 mol/L) 3.0 mL中和，搖勻。移取1.0 mL上述溶液至10 mL容量瓶，加入乙醇定容，搖勻，即得。取10 μL進HPLC分析，色譜圖見圖2-A。

3.3.2 堿降解實驗

精密稱取CBD樣品37.76 mg至容量瓶中，加入4.0 mL乙醇溶解樣品，之后加入3.0 mL NaOH (0.1 mol/L)，室溫放置1 h，再以HCl(0.1 mol/L) 3.0 mL中和搖勻，移取1.0 mL上述溶液至10 mL容量瓶，加入乙醇定容，搖勻，即得。取10 μL進HPLC分析，色譜圖見圖2-B。

3.3.3 氧化降解實驗

精密稱取CBD樣品35.36 mg至容量瓶中，加入4.0 mL乙醇溶解樣品，再加入1.0 mL 30%H2O2，室溫放置1 d，之后加入5.0 mL乙醇搖勻。移取1.0 mL上述溶液至10 mL容量瓶，加入乙醇定容，搖勻，即得。取10 μL進HPLC分析，色譜圖見圖2-C。

3.3.4 高溫、高濕、光照降解固體樣品

稱取320.18 mg、320.65 mg 、320.32 mg CBD樣品平鋪于3個扁形稱量瓶底部，樣品厚度約2 mm，分別置于45 ℃穩定性試驗箱、75%RH飽和氯化鈉棕色干燥器以及光照箱(4000 Lux，25 ℃)中，放置。分別于10 d、15 d、30 d取樣。每次從各扁形稱量瓶中稱取約30 mg樣品，至相應的100 mL容量瓶中，分別加入2/3體積的乙醇超聲溶解樣品，再以乙醇定容，搖勻，即得。各取10 μL進HPLC分析。高溫30d固體樣品色譜圖、高濕30 d固體樣品色譜圖、光照30 d固體樣品色譜圖分別見圖2-D、2-E、2-F。

3.3.5 高溫、高濕、光照降解液體樣品

精密稱取9份CBD樣品(每份約15 mg)至9個50 mL容量瓶中，分別加入2/3體積的乙醇超聲溶解樣品，各取3份置于45 ℃穩定性試驗箱、75%RH飽和氯化鈉棕色干燥器以及光照箱(4000 Lux，25 ℃)中，分別于10 d、20 d、30 d取樣。樣品取出后，加入乙醇定容，搖勻，即得相應時間的高濕、高濕和光照降解液體樣品。各取10 μL進HPLC分析。高溫30 d液體樣品色譜圖、高濕30 d液體樣品色譜圖、光照30 d液體樣品色譜圖分別見圖2-G、2-H、2-I。

3.3.6 未破壞樣品

精密稱取CBD樣品約15 mg至50 mL容量瓶中，先加入2/3體積的乙醇超聲溶解樣品，再加入乙醇定容，搖勻，即得。取10 μL進HPLC分析，色譜圖見圖2-J。

4 實驗結果

在各強制降解條件下，測得的CBD含量及降解雜質結果如表2所示。

大麻二酚在人為設定的酸、堿、氧化條件下，主峰降解5 %～10 %，主峰與相鄰雜質完全分開(分離度均>1.5)，主峰純度均>0.990。

大麻二酚固體在高溫(45 ℃)，高濕(75% RH)，光照(4000 Lux)條件下分別存放30 d均穩定。主峰與相鄰雜質的分離度均>1.5，主峰純度均>0.990。

大麻二酚溶液在高溫(45 ℃)，高濕(75% RH)條件分別存放30 d穩定，主峰與相鄰雜質的分離度均>1.5，主峰純度均>0.990。在光照(4000Lux)條件下存放10dCBD降解產生較大雜質(RRT0.966=0.2%)，紫外吸收光譜提示該雜質的與氧化降解樣品產生的RRT0.966的雜質為同一物質，且隨光照時間延長而增大，需要在大麻二酚的原料藥及制劑穩定性中重點關注。采用本文3.1部分的HPLC條件可以將該雜質與主峰完全分離(分離度>1.5)且主峰純度均>0.990，因此3.1部分的HPLC方法適用于光照樣品的檢測。

表2 各條件降解樣品中CBD含量和雜質

5 討論

強制降解實驗通過人為的設定破壞條件，使藥物在短時間內降解出雜質，反映出藥物的含量穩定性，以及可能出現的雜質，為藥物的包裝，儲存提供依據。并通過檢測強制降解樣品驗證藥物的檢測方法是否適用于藥物含量和有關物質的檢測。

在本次實驗中，在酸性(1 mol/L Hcl，室溫， 3 h)條件下降解至94.69 %，在堿性(0.1 mol/L NaOH，室溫，3 h)條件下降解至91.93%，在氧化(30% H2O2，室溫， 1 d)條件下降解至96.26%。說明大麻二酚在酸、堿、氧化條件下降解很快，對酸、堿、氧化耐受性差。

大麻二酚溶液在光照(4000Lux)條件下存放10 d產生較大雜質(RRT0.966=0.2%)，且該雜質隨光照時間延長而增大，但是大麻二酚固體在光照(4000Lux)條件下存放30 d并沒有明顯降解，說明大麻二酚固體對光穩定，但是配制成溶液后應盡量避光保存。

6 結論

通過大麻二酚的強制降解實驗可知，在大麻二酚類藥物的制劑處方設計及產品包裝儲存條件設定時應避免接觸酸、堿及氧化劑。大麻二酚溶液配制后對光穩定性差，應避免光照并及時使用。