基于SRAP技術的姜科植物遺傳多樣性分析

袁 琳，代亞坤，高炳淼

(海南醫學院 藥學院/熱帶轉化醫學教育部重點實驗室/海南省熱帶藥用植物研究開發重點實驗室 海南 海口 571199)

姜科植物在全世界約有52屬，1 500余種，分布于熱帶、亞熱帶地區[1]。常用的著名藥材為益智、砂仁、草豆蔻和紅豆蔻等，其中益智和砂仁為我國著名的四大南藥[2]。姜科植物中含有揮發油、黃酮類、甾體皂苷、雙苯庚烷類、萜類等多種化學成分，現代藥理學表明這些活性成分具有抗氧化、強心、抗癌、抗過敏、抗高血壓和提高免疫力等藥理活性[3-4]。近年來，由于過度采挖，導致其正常的繁殖方式、生長環境遭到破壞，野生資源已日漸枯竭，引起了科研工作者對姜科資源研究的重視。通過對姜科資源進行遺傳距離和聚類分析，可為其種質資源鑒定和遺傳變異研究提供理論依據與技術支持。因此，建立姜科資源遺傳多樣性的有效分析方法，對制定姜科資源的保護策略具有重要的意義[5]。

隨著遺傳分子科學的發展，基于PCR擴增技術的各種分子標記技術已得到廣泛應用[6-8]。但分子標記技術的復雜性、穩定性以及產生遺傳信息的能力各不相同，均有其優缺點[5]。SRAP作為一種新型分子標記技術結合了RAPD和AFLP的優點，高效、簡單、產率高、共顯性強、重復性高且不受所測樣品生長發育狀況、外界環境等眾多因素的影響[9]。該技術已成功地應用于遺傳多樣性研究、遺傳連鎖圖譜和指紋圖譜的構建及基因的克隆與定位[10-12]。目前，SRAP技術對姜科種質資源的遺傳多樣性研究力度不夠。為此，以海南島姜科植物為材料，運用SRAP技術擴增姜科植物的基因組獲得指紋圖譜，利用NTSYS-pc2.1和UPGMA分別分析其遺傳相似系數和構建遺傳聚類樹圖，分析姜科植物種群間的遺傳多樣性，以期為姜科植物資源的保護與利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品材料 11種姜科植物樣品均在海南省?？谑兄袊t學科學院藥用植物研究所(海南分所)南藥園圃采集(表1)。采集的新鮮姜科葉片放置在含硅膠的密封袋中，帶回實驗室于-80℃冰箱中保存。

表1 11種姜科植物樣品的來源信息

1.1.2 試劑 DNA Marker D2000、6×DNA loading buffer和植物基因組DNA提取試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司；SRAP引物，由深圳華大基因科技有限公司合成；瓊脂糖(Biowest Agarose)，購自海南合輝實業有限公司；核酸染料(Goidview)，購自上海賽百盛公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器 IBM型PCR擴增儀，北京六一生物科技有限公司；HYQ-2110型微型渦旋混勻器，美國精騏有限公司；DYY-6D電泳儀電源，北京六一生物科技有限公司；核酸蛋白測定儀，德國Eppendorf公司；HH-3型恒溫水浴鍋，邦西儀器科技(上海)有限公司；HY-JX5L型SDS-電泳槽，北京六一生物科技有限公司；SIGMA 1-14微型離心機，德國Sigma公司；Tanon 4100凝膠成像系統，上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用植物基因組DNA提取試劑盒(Plant DNA Mini Kits)提取，得到的DNA樣品保存于-20℃，具體步驟參考文獻[13]的方法進行?；蚪MDNA樣品經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測和凝膠成像系統拍照。

1.2.2 PCR擴增及多態性分析 以姜科植物基因組DNA為模板，利用引物組合f8r1對11種姜科植物樣品進行SRAP-PCR擴增。SRAP-PCR反應上游引物為sarp-f8：5′-TGA GTC CAA ACC GGA CT-3′；下游引物sarp-r1：5V-GAC TGC GTA CGA ATT AAT-3′[13]。PCR反應程序：94℃預變性3 min，第1個循環(94℃變性1 min，35℃復性1 min，72℃延伸1 min)循環5次；第2個循環(94℃變性1 min，50℃復性1 min，72℃延伸1 min)循環35次，72℃延伸1 min，4℃保存[13]。具體SRAP-PCR反應體系參考文獻[13]進行操作。PCR擴增產物取5μL經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。對明亮清晰的條帶進行統計，根據不同樣本的條帶位點判斷其多態性。

記錄電泳圖譜上條帶的有無，條帶清晰的記為“1”，條帶模糊或缺失的記為“0”，轉換成0/1矩陣。

1.3 數據分析

利用NTSYS-pc2.1計算11種姜科藥用植物的遺傳相似系數，并采用UPGMA進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 姜科植物基因組提取

從圖1看出，姜科植物的DNA樣品條帶明顯清晰、未見降解。核酸蛋白分析儀檢測DNA樣品的A260/A280為1.60～1.86，說明樣品條帶中RNA和蛋白質已基本剔除，DNA質量良好，可以作為后續PCR擴增的模版。

注：M：Marker ; 1～3：益智；4～6：紅豆蔻；7～9：陽春砂；10～12：草豆蔻；13～15：高良姜；16～18：光葉山姜；19～21：爪哇白豆蔻；22～24：海南砂仁；25～27：陽荷；28～30：大苞閉鞘姜；31～33：皺葉山姜。

Note: M, Marker; 1-3,A.oxyphylla; 4-6,A.Willd; 7-9,A.villosum; 10-12,A.katsumadai; 13-15, A. officinarum; 16-18,A.intermedia; 19-21,A.compactum; 22-24,A.longiligular; 25-27,Z.strioatum; 28-30,C.megalobraecea; 31-33, A. rugosa.

圖1 11種姜科植物基因組DNA電泳圖

Fig.1 Genomic DNA electrophoresis of 11 species of Zingiberaceae

2.2 SRAP-PCR擴增及多態性

從圖2可知，擴增產物片段大小在250～2 000 bp，部分條帶清晰明亮，大小合適，但也有部分條帶亮度較弱，不計入后期的數據統計。從表2可知，共獲得條帶59條，多態性條帶數為59條，多態性比率均為100%。

注：M：Marker ; 1～3：益智；4～6：紅豆蔻；7～9：陽春砂；10～12：草豆蔻；13～15：高良姜；16～18：光葉山姜；19～21：爪哇白豆蔻；22～24：海南砂仁；25～27：陽荷；28～30：大苞閉鞘姜；31～33：皺葉山姜。

Note: M, Marker; 1-3,A.oxyphylla; 4-6,A.Willd; 7-9,A.villosum; 10-12,A.katsumadai; 13-15, A. officinarum; 16-18,A.intermedia; 19-21,A.compactum; 22-24,A.longiligular; 25-27,Z.strioatum; 28-30,C.megalobraecea; 31-33, A. rugosa.

圖2 姜科植物的多態性擴增電泳結果

Fig.2 Polymorphic amplification electrophoresis of Zingiberaceae

2.3 遺傳多樣性與聚類分析

從表3可知，11種姜科植物材料間的遺傳相似系數在0.500 0～0.838 4，表明11種姜科植物間具有豐富的遺傳多樣性，草豆蔻與大苞閉鞘姜、海南砂仁與皺葉山姜、紅豆蔻與光葉山姜、陽春砂與陽荷兩兩間遺傳相似系數最大，均為0.838 4，表明其親緣關系最近。紅豆蔻與草豆蔻的相似系數僅0.500 0，從形態學上看，二者親緣關系較近，但從相似系數上看，二者親緣關系最遠。

表2 11種姜科植物的SRAP擴增數據

Table 2 SRAP amplification data of 11 species of Zingiberaceae

編號Number品種Variety總擴增帶數/條Number of total amplified bands 多態性帶數/條Number of polymorphicbands多態性條帶比率/%Ratio of polymorphic band1益智331002紅豆蔻661003陽春砂11111004草豆蔻551005高良姜551006光葉山姜771007爪哇白豆蔻661008海南砂仁661009陽荷4410010大苞閉鞘姜2210011皺葉山姜44100

表3 11種姜科植物的遺傳系數

從圖3可知，在遺傳相似系數0.500 0處11種姜科藥用植物分為兩大類，Ⅰ類包括益智、草豆蔻、大苞閉鞘姜、海南砂仁和皺葉山姜，其親緣關系較近。Ⅰ類可劃分為5個亞類，在遺傳相似系數為0.591 0處，益智單獨聚為一類；在遺傳相似系數為0.838 4處，草豆蔻和大苞閉鞘姜分別單獨聚為一類，海南砂仁和皺葉山姜分別單獨聚為一類，表明其親緣關系很近，益智與草豆蔻和大苞閉鞘姜、益智與海南砂仁和皺葉山姜親緣關系較遠。Ⅱ類包括紅豆蔻、光葉山姜、高良姜、陽春砂、陽荷和爪哇白豆蔻，其親緣關系較近。Ⅱ類可劃分為6個亞類，在遺傳相似系數為0.532 5處，爪哇白豆蔻單獨聚為一類，在遺傳相似系數為0.750 0處，高良姜單獨聚為一類，在遺傳相似系數為0.838 4處，紅豆蔻與光葉山姜、陽春砂與陽荷分別單獨聚為一類，表明其親緣關系很近。

注：1為益智，2為紅豆蔻，3為陽春砂，4為草豆蔻，5為高良姜，6為光葉山姜，7為爪哇白豆蔻，8為海南砂仁，9為陽荷，10為大苞閉鞘姜，11為皺葉山姜。

Note: 1,A.oxyphylla; 2,A.Willd; 3,A.villosum; 4,A.katsumadai; 5,A.officinarum; 6,A.intermedia; 7,A.compactum; 8,A.longiligulare; 9,Z.strioatum; 10,C.striolatum; 11,A.rugosa.

圖3 11種姜科植物的UPGMA聚類

Fig.3 UPGMA clustering of 11 species of Zingiberaceae

3 結論與討論

SRAP分子標記技術整合了RFLP、RAPD、SSR和AFLP的優點，具有操作過程簡單、擴增條帶清晰、結果穩定和重復性高等特點而廣泛應用于鐵皮石斛[14]、梔子[15]、紅花[16]、野生兜蘭[17]、石斛蘭[18]和海南降香黃檀[19]等遺傳多樣性研究。SRAP分子標記技術應用于姜科植物的研究相對較少。SRAP分子標記可有效用于姜科藥用植物的遺傳差異分析及物種鑒別，并利用SRAP分子標記進行姜科各屬內及屬間分類和親緣關系分析[20-21]。課題組前期研究優化了姜科益智的SRAP-PCR體系[13]，選擇已篩選引物f8r1對姜科資源進行SRAP分子標記分析，以期從分子水平確定姜科種質資源親緣關系，為姜科品種鑒定、品種保護提供理論依據，進而推動姜科資源更深層的開發利用。

研究結果表明，引物f8r1對姜科植物進行PCR擴增，獲得了條帶豐富且清晰的電泳圖譜，多態率均為100%，說明SRAP分子標記技術在姜科資源的遺傳多樣性研究中有很高的檢出率。因此，SRAP分子技術能很好的用于姜科植物物種間的遺傳多樣性分析[21]。UPGMA聚類分析表明，海南姜科植物資源具有豐富的遺傳多樣性。11種姜科植物分別為山姜屬6種，豆蔻屬3種，姜屬和閉鞘姜屬分別各1種。SRAP分子標記技術將11種姜科植物主要分為兩大類，Ⅰ類可以劃分為5個亞類：益智、草豆蔻、大苞閉鞘姜、海南砂仁和皺葉山姜。Ⅱ類可劃分為6個亞類，爪哇白豆蔻、高良姜、紅豆蔻、光葉山姜、陽春砂和陽荷。山姜屬的紅豆蔻、光葉山姜和高良姜親緣關系很近，與傳統分類結果一致。但山姜屬的益智、草豆蔻、紅豆蔻和皺葉山姜之間的親緣關系較遠，表明山姜屬內姜科植物同樣具有豐富的遺傳多樣性。豆蔻屬的海南砂仁、陽春砂和爪哇白豆蔻之間的聚類結果親緣關系較遠，而陽春砂與姜屬的陽荷親緣關系較近，海南砂仁與閉鞘姜屬的大苞閉鞘姜親緣關系最近。高麗霞等[21]研究發現，采用SRAP分子標記分析姜花屬植物系統分類中與傳統形態學之間存在差異。

研究以引物f8r1對姜科植物進行SRAP分析，構建了姜科植物的遺傳聚類圖譜，并分析了其遺傳多樣性，結果表明，姜科植物提取的DNA條帶明顯清晰、未見降解、質量良好。SRAP-PCR擴增共獲得條帶59條，均為多態性條帶，多態性比率均為100%。姜科植物的遺傳相似系數為0.500 0～0.838 4，其中草豆蔻與大苞閉鞘姜、海南砂仁與皺葉山姜、紅豆蔻與光葉山姜、陽春砂與陽荷兩兩間遺傳相似系數最大，均為0.838 4，表明其親緣關系最近。在遺傳相似系數0.500 0處，11種姜科藥用植物分為兩大類，Ⅰ類包括益智、草豆蔻、大苞閉鞘姜、海南砂仁和皺葉山姜。Ⅱ類包括紅豆蔻、光葉山姜、高良姜、陽春砂、陽荷和爪哇白豆蔻。