胎盤間充質干細胞外泌體對大鼠卵巢早衰修復作用的研究

馬麗麗，楊玲玲，楊海燕，黎跳寧

（1.寧夏醫科大學總醫院，寧夏 銀川；2. 寧夏醫科大學生育力保持教育部重點實驗室，寧夏 銀川）

0 引言

隨著腫瘤患者的治愈率和存活率的逐漸提高，放化療引起的卵巢早衰（POF）嚴重影響育齡女性腫瘤患者的生殖及心理健康。目前尚無有效的治愈辦法。近年來，外源性間充質干細胞( MSC) 療法為包括POF 在內的各種難治性疾病帶來了希望。國內外研究證實MSCs 攜帶的外泌體（exosomes）能夠進入體內減輕組織損傷程度，促進受損組織的修復，是干細胞領域具有重要研究價值的新興熱點。本研究通過對POF 模型大鼠腹腔注射人胎盤間充質干細胞（human placenta derived mesenchymal stem cells，hpMSCs）外泌體，檢測POF 大鼠卵巢功能，分析 hpMSCs 外泌體對大鼠卵巢功能的修復作用，為臨床治療POF 提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗選擇具有正常動情周期的SPF 級 SD 雌性大鼠60 只，10 周齡，體重200-220g。胎牛血清（Hyclone公司），exoEasyMaxiKit（德國 QIA-GEN 公司），ELISA試 劑盒購自R&D 公司，蘇木精染色試劑盒（北京博奧森生物有限公司），其他試劑購自sigma 公司。

1.2 實驗方法

按照實驗室常規程序，SD 大鼠每日腹腔注射環磷酰胺，腔注射環磷酰胺首劑量為50mg/kg，維持劑量為8mg/kg，連續注射 14ds，建立 POF 模型組。

實驗分為對照組，模型組和hpMSCs-EXO 治療組。模型建造成功后，hPMSC-EXO 治療組腹腔內隔日注射 150ug 外泌體蛋白（約 1×106hPMSC 產生），2周處死檢測各種指標。

1.3 外泌體的提取與鑒定

培養P3 代hpMSCs 細胞融合至70-80% 時，更換無血清培養基，培養48h，收集細胞培養上清。取 10mL培養上清，采用 ExoQuickTM 按5:1 比例提取 Exosome；BCA 蛋白定量試劑盒檢測 Exosome 蛋白含量；透射電鏡下觀察Exosome 的形態。

1.4 卵巢功能的測定

1.4.1 ELISA 法測定血清激素

取各組大鼠眶靜脈血，嚴格按照ELISA 試劑盒測定各組大鼠血清 FSH 和E2 的濃度。按照儀器靈敏度和批間、批內變異系數測定各組樣本，經儀器得出讀數，于標準曲線中讀出相應的濃度。

1.4.2 HE 染色法

頸椎脫位法處死大鼠，取卵巢，收集的卵巢經4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片常規蘇木素- 伊紅（HE）染色，觀察卵巢組織及卵泡的形態，同時在光學顯微鏡下計數各個時期的卵泡數量，進行比較。

1.4.3 統計學方法

2 結果

2.1 HpMSCs 外泌體透射電鏡下形態及蛋白表達

透射電鏡下觀察 Exosome 呈圓形或橢圓形的膜性小囊泡，大小不一，包膜完整，直徑30～100nm，囊泡內有低密度電子存在，其周圍有類脂膜性結構（圖1）。經Western Blotting 分析后，hpMSCs 外泌體表達表面抗原標記物CD9、CD63 等，不表達Lamp1（溶酶體標志物）和Calnexin（內質網標志物），說明本研究提取的外泌體，無溶酶體與內質網成分（圖2）。

圖1 透射電鏡下 Exosome 形態(×25000)

圖2 胎盤間充質干細胞及exsomes 相關標記物的 Western Blotting 條帶圖注：a 胎盤間充質干細胞；b 提取出的exsomes

2.2 HpMSCs 移植前后大鼠血清FSH、 E2 測定

HpMCs-EXO 治 療 組 FSH 明 顯 低 于 模 型組（P＜0.05），E2 值明顯高于模型組（P＜0.05），二者與對照組相比均無顯著性差異（P＞0.05）。表明治療組FSH、 E2 值均接近對照組水平。見表1。

表1 各組大鼠血清FSH、E2 水平

2.3 hpMSCs 移植前后各組卵巢卵泡計數

由表2 可以看出，相比POF 模型組，hpMCs-EXO治療組卵巢內各級卵泡數目均有明顯增加，組間差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠卵巢卵泡計數比較

2.4 卵巢結構 HE 染色

HE 染色結果顯示，hpMSCs-EXO 治療組可見各級卵泡，成熟卵泡存在，見間質纖維化，壞死；未移植組結構混亂，有閉鎖卵泡存在，組織開始纖維化，壞死（見圖 3）。

圖3 卵巢HE 染色（×400）（a POF 組 b hpMSCs 治療組）

3 討論

干細胞移植治療越來越多的被應用于改善及治療某些疾病。hPMSCs 目前證實是干細胞的最佳來源。相較于其他干細胞，hPMSCs 具有來源方便，細胞數量充足，易于分離、培養、擴增和純化，傳代擴增30 多代后仍具有干細胞特性。研究證明[1-2]：hPMSC 分泌的細胞因子如血管內皮生長因子(VEGF)、肝細胞生長因子(HGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) 和胰島素樣生長因子(IGF) 等可抑制已受損靶細胞的凋亡，修復已受損的組織細胞。NaYi[3]等研究報道hPMSC 可以使Akt 磷酸化，激活PI3K/Akt 信號通路，減少POF小鼠卵巢中顆粒細胞凋亡，從而改善卵巢功能。另有實驗結果顯示[4-5]，hPMSC 在體內外能抑制化療藥物誘導的卵巢顆粒細胞凋亡，通過分泌抗氧化物質修復化療所致卵巢損傷，部分改善卵巢發育微環境及內分泌功能，之后發現給環磷酰胺所致POF 的大鼠移植hPMSCs 后，可通過SIRT1/PGC1-a/Nrf2 信號通路激活，改善卵巢內分泌的功能，減少卵巢纖維化，提高卵巢抗氧化功能[6]。但與正常的卵巢功能還存在一定差距。

近年來有關細胞分泌的外泌體(exosomes)的功能和作用機制的研究已成為熱點。exosomes 是一類直徑在30-100nm，含有RNA 和蛋白質的囊泡，具有脂質雙層膜結構，存在于機體幾乎所有的體液中。SUN L 等[7]研究發現人臍帶間充質干細胞(UCMSC)分泌的外泌體可以融入順鉑損傷的卵巢顆粒細胞，通過上調抗凋亡蛋白 Bcl-2 表達，下調促凋亡蛋白 Bax 表達，加速卵巢功能的恢復。Xiao 等[8]報道在化療藥物導致的POF大鼠模型中，來源于羊水間充質干細胞的外泌體，富含miR-146a 和 miR-10a 兩種 microRNA（miRNAs），其中miR-146a 通過下調Irak1 和traf632 表達，miR-10a通過抑制Bim 表達，下調Caspase-9 表達，從而抑制顆粒細胞凋亡和減少卵泡閉鎖，恢復損傷卵巢的功能。也有學者發現[9]人羊膜上皮細胞(hAEC) 外泌體通過轉移功能性miRNA（如miR-1246）抑制化療誘導的顆粒細胞凋亡,恢復POF 小鼠卵巢功能。

目前尚無hpMSCs 外泌體對POF 大鼠卵巢功能修復的研究報道。本實驗用hpMSCs 外泌體移植修復化療損傷大鼠卵巢，結果顯示卵巢內各級卵泡數目均有明顯增加，證實了hpMSCs 外泌體能夠通過旁分泌的方式發揮對化療所致卵巢損傷的保護作用。但外泌體究竟通過何種機制發揮其改善卵巢功能的生物學效應，需要后續進一步的實驗研究。