自噬與2型糖尿病牙周炎的組織學和細胞學研究

王芳 趙玉紅 張海云 何萍 吳紅霞 吳鳴蕾 胡濟安

糖尿病是與遺傳和自身免疫相關的全身性慢性代謝性疾病，炎癥在2型糖尿病發病機制中的作用備受關注。牙周炎使牙周組織處于炎癥環境，炎癥引起胰島細胞結構和功能障礙，可導致2型糖尿病發生[1]。2型糖尿病與牙周炎相互作用又相互促進[2]。自噬是細胞在自噬相關基因的調控下發生、發展、老化、死亡過程中存在的一個自我消化和再循環系統[3]。細胞通過自噬降解蛋白質和受損的細胞器。自噬在基礎狀態和應激情況下對胰島細胞數量、結構和功能均發揮了重要的作用，在糖尿病的發生、發展中起到重要作用。自噬相關蛋白ATG5/ATG1可以與干擾素（IFN）中的IFN-β結合而阻斷IFN的信號通路[4]。自噬發生過程中有兩個類泛素化修飾過程，分別發生在ATG5-ATG12系統和微管相關蛋白輕鏈3（microtubule-associated proteins light chain 3，LC3）系統中，對于自噬泡的延伸與自噬體的成熟有重要意義。自噬關鍵調控蛋白復合物Beclin1是ATG6的同系，通過調節蛋白質的合成和降解以及細胞器的更新來維持細胞穩態，Beclin1與多種急、慢性疾病的發生密切相關[5]。自噬受體蛋白（Sequestosome-1，P62）為髓細胞病毒基因C的表達產物，轉錄調控的靶基因參與細胞周期的調控、增殖、凋亡及永生化等過程，在諸多自噬和炎癥的發生中起著重要作用[6]。LC3是自噬的生物標志物[7]，自噬形成時，其與磷脂酰乙醇胺共價結合，結合在自噬體膜上的LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可評估自噬水平的高低?；诖?，本研究通過組織學和細胞學研究檢測并比較 ATG1、ATG12、LC3、P62、Beclin1 在正常牙齦黏膜組織、口腔慢性牙周炎組織和2型糖尿病牙周炎穩定期組織中的表達差異，探討自噬對2型糖尿病牙周組織的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源 組織標本選取自2015年1月至2019年6月在杭州市余杭區第五人民醫院經手術切除并經病理學檢查確認的5例口腔慢性牙周炎患者（其中男3例，女2例；年齡46～65歲）和5例2型糖尿病牙周炎穩定期患者（其中男2例，女3例；年齡48～63歲）的翻瓣黏膜組織。另擇在杭州市余杭區第五人民醫院種植牙的5例患者（其中男3例，女2例；年齡47～59歲）的正常牙齦黏膜組織（種植牙修建的邊緣牙齦黏膜組織）作為對照。本研究經杭州市余杭區第五人民醫院醫學倫理委員會批準，受試者知情同意并簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑 ATG1、ATG12、P62鼠源單克隆（美國 Invitrogen公司），LC3-Ⅱ，LC3-Ⅰ，Beclin1兔源多克隆抗體（美國Sigma公司），波形蛋白Vimentin（北京中杉金橋公司）；廣譜細胞角蛋白Ck（pan）（北京中杉金橋公司）；DMEM培養基（美國Gibico公司）；胰蛋白酶（美國Gibico公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH（美國Thermo公司），免疫組化SP試劑盒（北京中杉金橋公司）；兔抗鼠FITC-IgG、羊抗兔FITC-IgG等（北京中山生物技術有限公司）。DAB顯色劑（福州邁新生物技術開發有限公司），MTT試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.1.3 主要儀器 倒置相差顯微鏡ckx41（日本Olympus公司）；CO2培養箱水套式 s-a305714-7787（美國Thermo公司）；紫外分光光度計UV1206（日本Shimodzu公司）；凝膠掃描系統DF23B（英國UVP公司）；電泳系統Mini Protean（美國Bio-Rad公司）；低溫離心機5424R（美國Eppendorf公司）；倒置熒光顯微鏡Eclipse80i（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 組織塊培養與細胞原代培養 無菌條件下刮取正常牙齦黏膜、口腔慢性牙周炎和2型糖尿病牙周炎穩定期翻瓣黏膜組織行體外培養，參照文獻[8]進行組織塊法原代培養。蓋玻片+組織塊培養原代細胞，并作常規傳代培養，取2代細胞經免疫細胞化學檢測呈Vimentin陽性、Ck（pan）陰性，則證實細胞來源于中胚層。牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞經腫瘤壞死因子α（TNF-α）陽性證實炎癥存在，進行后續實驗。

1.2.2 正常牙齦黏膜組織、慢性牙周炎組織和2型糖尿病牙周炎穩定期組織 ATG1、ATG12、Beclin1、P62 表達情況檢測 采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）法。將 ATG1、ATG12、Beclin1、P62 一抗分別加入3種組織切片，再加入用生物素標記的二抗與一抗結合，使用SP放大系統產生低背景、高放大效果來測定組織細胞中的抗原?？乖迯筒捎酶邷馗邏悍?，抗原修復用EDTA抗原修復液，一抗反應為37℃、2h，免疫組化以抗 ATG1、ATG12、Beclin1、P62 抗體染色細胞的細胞核或細胞質呈棕黃色顆粒狀著色為陽性表達。

1.2.3 正常牙齦、慢性牙周炎和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞ATG1、ATG12、Beclin1、P62、LC3-II、LC3-I表達情況檢測分別將1×106個/ml對數生長期的正常牙齦、慢性牙周炎和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞懸液接種于底部鋪有蓋玻片的6孔培養板內，37℃、5%CO2飽和濕度下培養24h，加入ATG1、ATG12、Beclin1、P62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ一抗，以加入PBS作為陰性對照；24h后，取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定后，按免疫細胞化學試劑盒說明書進行操作檢測表達情況。

1.2.4 正常牙齦、慢性牙周炎和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞 ATG1、ATG12、Beclin1、P62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表達水平檢測 采用Western blot法。將正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞接種于含10%滅活胎牛血清的DMEM培養基中，在37℃、5%CO2飽和濕度下培養，每1～2d換液1次。取對數生長期細胞，經4℃胞漿蛋白提取液裂解，提取物在冰上孵育2h，然后12 000g、4℃離心10min；沉淀后加入4℃預冷核蛋白提取液，震蕩混勻，冰浴1h，再12 000g 4℃離心30min；取上清液為核蛋白，其蛋白濃度經考馬斯亮藍法定量，GAPDH為內參。核蛋白中加入等體積上樣緩沖液煮沸5min，進行凝膠電泳，將蛋白轉至PVDF膜后用5g/L牛血清白蛋白室溫下封閉 2 h，分別用 ATG1、ATG12、Beclin1、P62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ抗體4℃孵育過夜，用PBS充分洗滌，再加入辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠（1∶5 000）或羊抗兔IgG（1∶5 000）。結果使用Motic圖像分析系統測量平均灰度值。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正常牙齦黏膜組織、慢性牙周炎組織和2型糖尿病牙周炎穩定期組織 ATG1、ATG12、Beclin1、P62 表達情況 正常牙齦黏膜組織、慢性牙周炎組織和2型糖尿病牙周炎穩定期組織中 ATG1、ATG12、Beclin1、P62免疫組化染色結果顯示ATG1、ATG12表達相似，在正常牙齦黏膜組織中呈強陽性表達，在慢性牙周炎組織中呈弱陽性表達，在2型糖尿病牙周炎穩定期組織中呈陽性表達。Beclin1在正常牙齦黏膜組織中呈強陽性表達，在慢性牙周炎組織中呈弱陽性表達，在2型糖尿病牙周炎穩定期組織中呈陽性表達。P62在正常牙齦黏膜組織中呈弱陽性表達，在慢性牙周炎組織中呈弱陽性表達，在2型糖尿病牙周炎穩定期組織中呈陽性表達，見圖 1-12（插頁）。

2.2 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞 ATG1、ATG12、P62、Beclin1表達情況 ATG1、ATG12在正常牙齦成纖維細胞中強陽性表達，在慢性牙周炎成纖維細胞中弱陽性表達，在2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中弱陽性表達。P62在正常牙齦成纖維細胞弱陽性表達，在慢性牙周炎成纖維細胞中表達增高，在2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中表達更高。Beclin1在正常牙齦成纖維細胞中強陽性表達，在慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中弱陽性表達，見圖13（插頁）。

圖1 ATG1在正常牙齦黏膜中強陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖2 ATG1在慢性牙周炎組織中弱陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖3 ATG1在2型糖尿病牙周炎穩定期組織中陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖4 ATG12在正常牙齦黏膜中強陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖5 ATG12在慢性牙周炎組織中弱陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖6 ATG12在2型糖尿病牙周炎穩定期組織中陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖7 Beclin1在正常牙齦黏膜組織中強陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖8 Beclin1在慢性牙周炎組織中弱陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖9 Beclin1在2型糖尿病牙周炎穩定期組織中陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖10 P62在正常牙齦黏膜中弱表達（免疫組化染色，×200）

圖11 P62在慢性牙周炎組織中陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖12 P62在2型糖尿病牙周炎穩定期組織中陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖13 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞ATG1、ATG12、Beclin1、P62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表達情況（注：a：ATG1在正常牙齦成纖維細胞中強陽性表達；b：ATG1在慢性牙周炎成纖維細胞中弱表達；c：ATG1在2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中弱表達；d：ATG12在正常牙齦成纖維細胞中強陽性表達；e：ATG12在慢性牙周炎成纖維細胞中弱表達；f：ATG12在2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中弱表達；g：P62在正常牙齦成纖維細胞弱陽性表達；h：P62在慢性牙周炎成纖維細胞中弱陽性表達；i：P62在2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中弱陽性表達；j：Beclin1在正常牙齦成纖維細胞中強陽性表達；k：Beclin1在慢性牙周炎成纖維細胞中弱陽性表達；l：Beclin1在2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中弱表達；免疫熒光染色，×200）

2.3 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表達水平比較 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。2型糖尿病牙周炎成纖維細胞LC3-Ⅱ表達水平＞慢性牙周炎成纖維細胞＞正常牙齦成纖維細胞（均P＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值＜慢性牙周炎成纖維細胞＜正常牙齦成纖維細胞牙周炎成纖維細胞（均P＜0.05），見圖14、表1。

圖14 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表達電泳圖

表1 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表達水平比較

2.4 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞ATG1、ATG12、Beclin1、P62表達水平比較 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞ATG1、ATG12、Beclin1、P62表達水平比較差異均有統計學意義（均 P＜0.05）。ATG1、ATG12、P62在 2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中表達水平最低（均P＜0.05），Beclin1在2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中表達水平最低高（均P＜0.05），見圖 15、表 2。

圖15 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞ATG1、ATG12、Beclin1、P62表達電泳圖

表2 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞ATG1、ATG12、Beclin1、P62表達水平比較

3 討論

2016年諾貝爾生理學醫學獎授予發現了細胞自噬機制的Yoshinori Ohsumi，自噬是細胞降解和回收其成分物的過程[9]。自噬過程往往與機體多種代謝性疾病的發生直接相關，如2型糖尿病和糖尿病合并癥等。研究者認為，自噬是細胞進行質量控制的一種特殊方式，如果無法進行有效的自噬過程，細胞就無法自我更新，從另一方面來講，如果自噬過多，也會破壞細胞自身組分的平衡，進而誘發細胞死亡，因此適度調節的自噬過程對于維持機體健康至關重要[10]。盡管自噬作用的錯誤調節可能與多種疾病有關，其中包括它在胰腺β細胞和葡萄糖代謝過程中的作用并未有一致性的結論[11]。有學者利用特異性去除Atg7基因胰腺β細胞的小鼠進行研究，發現Atg7變異的小鼠表現出葡萄糖耐量減低以及血清胰島素濃度的降低。由于細胞凋亡的增加以及β細胞分裂增生程度的降低，導致β細胞數量和胰腺中胰島素的減少[12]。

慢性牙周炎組織和2型糖尿病牙周炎穩定期組織中，常規顯微鏡下可以觀察到炎癥的浸潤方式和血管擴張的形態稍有不同，單純細菌引起的慢性牙周炎，炎癥細胞聚集于結合上皮和溝內上皮下方，下方固有層內血管擴張，而2型糖尿病伴發的牙周炎中炎癥細胞沿著固有層擴張的血管內壁和上皮釘突的下方。有研究證實自噬在牙周膜細胞的分化中起作用[13]。本研究首先通過免疫組化檢測正常牙齦黏膜組織、慢性牙周炎組織和2型糖尿病牙周炎穩定期組織中 ATG1、ATG12、Beclin1、P62的表達，染色結果顯示ATG1、ATG12、Beclin1表達模式相似，在正常牙齦黏膜組織中呈強陽性表達，在慢性牙周炎組織中呈弱陽性表達，在2型糖尿病牙周炎穩定期組織中的表達接近慢性牙周炎組織，陽性表達介于正常牙齦黏膜組織和慢性牙周炎組織之間。P62的表達和ATG1、ATG12、Beclin1表達相反。接著本研究選取組織的原代細胞，對照組織學進行了細胞學研究。結果表明ATG1、ATG12、Beclin1、P62在正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中的表達方式與其在組織中的表達相似，提示口腔慢性牙周炎穩定期和2型糖尿病牙周炎穩定期患者牙齦黏膜細胞自噬減弱。

LC3是檢測自噬水平的標志性蛋白，有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式，當細胞內自噬水平升高時，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化增加，進而使LC3-Ⅱ的含量增多[14]。因此通過檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值的變化可反映自噬體數目或自噬水平的變化。生理學分析顯示，在小鼠中存在血糖激發的胰島素分泌的降低，并且自噬作用缺陷的β細胞中血糖誘導的細胞內鈣離子瞬變過程也被破壞。而形態學分析則表明存在泛素蛋白的聚集，這種現象與P62共存，并伴隨著線粒體腫脹、內質網膨脹以及β細胞液泡的變化。以上研究結果表明自噬作用對于維持胰腺β細胞的結構、數量以及功能都是非常重要的，自噬作用的破壞將導致胰島素的缺乏以及高糖血癥的發生[15]。

本研究應用Western blot定量分析各組細胞內LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值變化，同時檢測自噬相關蛋白ATG1、ATG12、Beclin1、P62蛋白表達，提示2型糖尿病牙周炎成纖維細胞比正常牙齦的成纖維細胞自噬降低，與非糖尿病牙周炎相比也有所下降，表明自噬參與牙周炎過程，并且與2型糖尿病自噬可能有協同作用。有學者發現了糖尿病小鼠以及高脂飲食小鼠的胰腺β細胞中存在自噬作用的升調節，能導致糖尿病相關的外周胰島素抵抗的游離脂肪酸誘導胰腺β細胞自噬作用發生。對于atg7基因的消除將導致胰島退化、胰島素分泌以及葡萄糖耐量降低。與此同時研究人員還觀察到，盡管在對照組小鼠中高脂肪含量的飲食能激發胰腺β細胞自噬，但是對于自噬不足變異小鼠而言，這將形成葡萄糖耐量的惡化，以上現象發生的部分原因在于缺乏胰腺β細胞數量的補償性增加[16]。另有研究表明，當存在高脂肪飲食誘導的胰島素抵抗時，自噬作用是一種胰腺β細胞的獨特適應性反應。因此，基礎自噬作用對于維持正常的胰島結構和功能至關重要[17]。

綜上所述，本研究發現自噬與2型糖尿病牙周炎的發生存在復雜關系，在口腔慢性牙周炎和2型糖尿病牙周炎穩定期自噬呈現下降。細胞自噬在2型糖尿病這一代謝性疾病中扮演了重要角色。如能找到引發2型糖尿病牙周炎異常自噬過程的靶點，以此來研發新型治療方法，或能助于疾病的早期診斷并預防多種代謝性疾病的發生。