榅桲C4H基因的克隆、序列分析及表達

車玉紅，楊 波，郭春苗，劉晨曦，木巴熱克·阿尤普，吳津蓉，杜 鵑

（1.新疆農業職業技術學院，新疆 昌吉 831100；2.新疆農業科學院 園藝作物研究所，新疆 烏魯木齊 830091； 3.新疆畜牧科學院 生物技術研究所，新疆 烏魯木齊 830011）

榅桲Cydonia oblonga的英文名為Quince，是薔薇科榅桲屬落葉灌木或小喬木，作為世界上古老的樹種之一，已有4 000年以上的栽培歷史[1]。該樹種在世界各國均有分布，我國主要分布于西北地區的新疆、陜西等省區，在東北地區也有少量的分布[2-3]。成熟后的榅桲果實也叫新疆木瓜，別名為比也、土木瓜、木梨。在榅桲栽培面積最大的新疆維吾爾自治區內，其分布主要集中在天山南部地區塔里木盆地邊緣的綠洲上，特別是在喀什地區其栽植面積達200 多hm2[4-5]。目前對榅桲的研究偏向于其藥用價值的挖掘和臨床應用，已有研究者從榅桲果實中發現了鞣質類、氨基酸類、揮發油類、有機酸類及黃酮多種生理活性成分[6-7]。在食用方面，榅桲果實主要用于抓飯的輔助材料及制作果醬、罐頭等產品，榅桲果實因其果肉高度木質化而鮮食口感欠佳[8]。

榅桲果實果肉的木質化與木質素的代謝緊密相關[9]，而肉桂酸-4- 羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）是苯丙烷代謝途徑中的關鍵酶之一，該酶的含量作為調節木質素、黃酮類化合物、芳香類化合物等下游產物的重要途徑而成為近年來國內外學者研究的熱點[10]。作為細胞色素氧化酶（cytochromeP450）家族CYP73亞家族的重要成員之一，C4H基因目前已從豌豆、芒果、青稞、番茄、獨行菜、苦蕎、綠豆、大豆、桂花等作物中克隆得到[11-16]，相應的C4H基因的結構特點被進一步研究，該基因的表達量與果實重要品質形成之間的聯系也得到了廣泛的關注，如Millar 等[17]通過轉基因技術抑制C4H基因的表達顯著減少了番茄中的木質素含量。

目前，關于榅桲的研究主要集中在其營養成分[3]、香氣[4]、果實藥用價值[6-8]等方面，而關于其C4H基因的鑒定研究尚屬空白。因此，以不同發育時期榅桲的果肉為研究對象，根據GeneBank數據庫中已登錄的C4H基因序列，針對高度同源性區域，采用Oligo 6.0 軟件設計榅桲C4H基因序列的引物，以反轉錄獲得的榅桲果實組織的cDNA為模板，利用高保真酶PrimeStar 進行榅桲C4H基因全長編碼區擴增，以期得到榅桲果肉中C4H基因序列、結構等信息和該基因在榅桲果實發育過程中的表達規律，為進一步揭示榅桲果實木質化的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料主要采自喀什地區莎車縣伊什庫里鄉榅桲示范園，以大果榅桲為主，榅桲樹齡達15 a，土肥管理一致。

1.1.1 樣品的采集

分別采集落花后10（4月21日）、40（5月21日）、70（6月21 日）、100（7月21 日）、130（8月21 日）、160 d（9月21 日）的榅桲果實，測量所采樣品的基礎數據（結果見表1）后將其送至烏魯木齊的實驗室，于-80 ℃的超低溫冰箱中保存。

表1 榅桲果實發育規律的測定結果Table 1 Determination result of fruit development rule in C.oblonga

1.1.2 試 劑

T4 DNA 連接酶、PrimerSTAR DNA 聚合酶和M-MLV 反轉錄酶，均由大連TaKaRa 公司提供；質粒提取試劑盒，由QIAGEN 公司提供；榅桲果肉總RNA 提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒，均由北京天根公司提供；其他化學試劑均為國產分析純試劑。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA 的提取和cDNA 的合成

首先取榅桲果實樣品100 mg，用液氮低溫研磨后參照植物多糖多酚總RNA 提取試劑盒中說明的操作流程提取榅桲總RNA[17-20]，提取結束后，配置1%的瓊脂糖凝膠以用于檢測RNA 是否完整，并用紫外分光光度計測定提取后的RNA 濃度，根據瓊脂糖凝膠與紫外分光光度計的檢測結果，篩選出提取質量較高的RNA 樣品，將其保存于-80 ℃ 的冰箱中。以得到的榅桲果實組織的總RNA 模板，反轉錄得到榅桲果實組織的cDNA。

1.2.2 基因克隆

根據GeneBank 數據庫中已登錄的C4H基因序列，選取以下5 個物種進行同源性比對， 選擇甜櫻桃（Prunus avium，XP_021806844.1）、山 杏（Prunus armeniaca，VVA16404.1）、 紅莓 （Rubus coreanus，ABX74779.1）、玫瑰（Rosa rugosa，AKT71850.1）、麻風樹（Jatropha curcas， XP_012078176.1）等5 個近源物種的序列，針對高度同源性區域，采用Oligo 6.0 軟件設計了榅桲C4H基因序列的引物（C4H-senese：ATGGATCTCCTCCTTCTGGAAAAG；C4Hantisenese：CTTGTTGGTGAAGAAGGGGAC）。以反轉錄獲得的榅桲果實組織的cDNA 為模板，利用高保真酶PrimeStar 進行榅桲C4H基因全長編碼區擴增，反應體系如下：cDNA 2 μL，5×PS buffer 2.5 μL，dNTP (2.5 mmol/L） 2 μL，正反向引物 （10 mmol/L）各1 μL，Primer Star 酶（2.5 U/μL） 1 μL，用ddH2O 補充至25 μL。PCR 反應條件為：94 ℃、3 min，94 ℃、30 s，62 ℃、30 s，72 ℃、2 min，72 ℃、5 min，30 個循環。采用DNA 膠回收試劑盒回收PCR 產物，并將其連接至pMD-19T載體（TAKARA）上，最后將連接產物送至上海生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.3 序列分析與結構預測

榅桲C4H基因編碼蛋白的氨基酸殘基數量與組成結構，其相應蛋白質的分子量、等電點、親水/疏水特點，采用ExPASy ProtParam（http://cn.Expasy.org）與 ScanProsite 程序進行預測分析；蛋白質的二級結構，采用PredictProtein（https://www.predictprotein.org/getqueries）進行預測分析； 蛋白質的三級結構，采用Swiss-model（http://swissmodel.expasy.org/）進行預測分析。同源序列比對，采用DNAstar 軟件完成；系統進化樹的構建，采用MEGA 5 軟件完成。

1.2.4 實時定量熒光PCR 檢測

利用實時定量熒光PCR 對不同發育時期榅桲果實中C4H基因的表達情況進行了分析。使用液氮研磨處理榅桲不同發育時期的果實樣品并提取總RNA，使用反轉錄試劑盒得到總RNA，將其作為模板反轉錄得到榅桲不同發育時期果實組織的cDNA。實時熒光定量檢測，采用羅氏的Light Cycler 480 熒光定量PCR 儀進行。反應體系為：2×SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL；正反向引物均為0.25 μL；cDNA 模板2 μL；加水補足至10 μL， 每個樣品的檢測各設3 次重復。實時PCR 擴增程序為兩步法PCR 擴增標準程序。步驟1：預變性，95 ℃、30 s（20 ℃/s）， 1 個循環。步驟2：PCR反應，95 ℃、5 s（20 ℃/s），60 ℃、20 s（20 ℃/s），40 個循環。步驟3：溶解曲線分析，95 ℃、0 s （20 ℃/s），65 ℃、15 s（20 ℃/s），95 ℃、0 s （0.1 ℃/s）。利用2-ΔΔCT 法對cDNA 中榅桲C4H基因的相對表達量進行統計分析。通過BestKeeper和GeNorm 軟件分析，選擇評分和穩定性較高的三磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）作為內參基因進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 榅桲C4H 基因的PCR 擴增

以榅桲果實cDNA 為模板進行PCR 擴增，結果如圖1 所示。由圖1 可知，產物條帶大小約為 1 500 bp，與預期的大小相符。將PCR 產物與pMD-19T 載體進行連接，轉化入感受態細胞后，提取質粒，利用HindIII 和BamH I 雙酶切后，獲得大小為1 500 bp 的產物，其與預期的大小一致。

圖1 榅桲C4H 基因的PCR 擴增和鑒定電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification and identification of C4H gene in C.oblonga

2.2 榅桲C4H 基因的克隆

PCR 產物經回收、克隆和菌落PCR 鑒定后，對其陽性克隆進行測序，結果如圖2 所示。圖2表明，PCR 所得開放閱讀框（ORF）的長度為 1 518 bp，編碼505 個氨基酸，以ATG 為起始密碼子，以TAG 為終止密碼子。

圖2 榅桲C4H 基因的核苷酸和氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino sequences of C4H gene in C.oblonga

2.3 榅桲C4H 基因編碼蛋白的生物信息學分析

2.3.1 榅桲C4H基因編碼蛋白的氨基酸組成及理化性質分析

榅桲C4H 蛋白的氨基酸序列的預測結果見 表2。由表2 可知，Leu、Val、Arg、Glu、Ile 等氨基酸的使用頻率均較高，Leu、Val、Arg、Glu、Ile的使用頻率依次為11.88%、8.51%、8.32%、7.13%、6.73%。榅桲C4H 蛋白的分子質量為58.28 kD，其等電點為9.30，分子式為C2641H4217N729O718S19， 63 個帶負電荷的氨基酸殘基為（Asp+Glu），74 個 帶正電荷的氨基酸殘基為（Arg+Lys），不穩定系數為46.19，說明榅桲C4H 蛋白屬于不穩定蛋白。

2.3.2 榅桲C4H基因編碼蛋白親水/疏水性的分析

榅桲C4H 蛋白疏水/親水性分析結果如圖3所示。圖3 表明，在榅桲C4H 蛋白氨基酸中，第17 與第19 位氨基酸殘基的疏水性均最強（分別為3.600 和3.578），第127 與第196 位氨基酸殘基的親水性均最強（分別為-3.067 和-2.722）；另外，在該蛋白中親水氨基酸的數量遠高于疏水氨基酸的數量，由此推斷，榅桲C4H 蛋白為親水性蛋白。

表2 榅桲C4H 基因編碼蛋白的氨基酸的組成Table 2 Composition of amino acids coded by C4H gene in C.oblonga

圖3 C4H 基因編碼蛋白親水/疏水性的預測結果Fig.3 Prediction result of hydrophobicity/rophilicity of protein coded by C4H gene

2.3.3 榅桲C4H基因編碼蛋白二級結構和三級結構的預測

榅桲C4H 蛋白二級結構的預測結果表明，該蛋白的主要結構為α 螺旋和無規卷曲，而其α 螺旋（Alpha helix）的占比最高，達47.52%；β 折疊（Extended strand）的占比最低，僅為7.33%；無規卷曲（Random coil）的占比為45.15%。

使用SWISS-MODEL 進行預測并構建榅桲C4H 蛋白的三級結構：將榅桲C4H 蛋白序列提交至SWISS-MODEL 后，通過對目標蛋白序列的相似性進行比對分析，可找到同源性最高的模板，模板氨基酸序列的一致性為34%，以第30 ～502位的氨基酸建模，模型覆蓋率為92%，榅桲C4H蛋白的三級結構預測結果圖4 所示。

2.3.4 榅桲C4H基因的同源性比對分析

通過DNAstar，將榅桲C4H基因全長編碼區序列與NCBI 上公布的其他物種的氨基酸序列進行同源性比對分析，結果如圖5 所示。圖5 顯示，榅桲的C4H基因序列與甜櫻桃（Prunus avium，XP_021806844.1）、 山杏（Prunus armeniaca，VVA16404.1）海棠（Malus domestica，NP_001281035.1）、 紅莓（Rubus coreanus，ABX74779.1）、 玫瑰（Rosa rugosa，AKT71850.1）、 木薯（Manihot esculenta，XP_021601102.1）等物種的C4H基因序列的相似度均較高，分別為92.87%、91.24%、87.25%、86.45%、85.29%、85.26%；而其與麻風樹（Jatropha curcas，XP_012078176.1）、 巴豆（Croton stellatopilosus，AYM55654.1）、 獨角金（Striga asiatica，GER54616.1）、大麻（Cannabis sativa，XP_030504384.1）、 橄欖（Canarium album，ACR10242.1）等物種的C4H基因序列的相似度均超過80%。

圖4 C4H 蛋白三級結構的預測結果Fig.4 Prediction result of tertiary structure of C4H protein

2.3.5 榅桲C4H 蛋白的氨基酸組成及進化樹分析

利用MAGA 5.0 軟件，使用Neighbor-joining法中重復1 000 次抽樣的方法，對同源比對的所有序列進行系統進化樹分析，結果如圖6 所示。圖6顯示，與榅桲C4H 蛋白親緣關系最近的物種是甜櫻桃，其次為山杏，三者的C4H蛋白屬于同一分支；而紅梅、海棠等物種的C4H 蛋白則與榅桲C4H 蛋白的親緣關系均較遠。

2.4 榅桲C4H 基因在果實發育時期表達的定量分析

為了進一步研究C4H基因與榅桲果實發育過程中木質素積累的相關性，分別對花后10、40、70、100、130、160 d 的榅桲果實的C4H基因表達進行了定量分析，結果如圖7 所示。在榅桲果實發育過程中，C4H基因的相對表達量，在其果實發育早期最高，而后逐漸下降；花后10 d 時C4H基因的相對表達量最高，花后160 d 時C4H基因的相對表達量最低，僅約為花后10 d 時的1/3。

圖5 榅桲C4H 基因同源性對比分析結果Fig.5 Homology analysis result of C4H gene in C.oblonga

圖6 榅桲C4H 蛋白的進化樹Fig.6 Cladogram of C4H protein in C.oblonga

圖7 不同發育時期果實中C4H 基因的相對表達量Fig.7 Relative expression of C4H gene in fruit at different development stages

3 討 論

在植物的生長發育成熟過程中，木質素單體通過聚合反應形成木質素的大分子物質，這類大分子物質沉積在細胞壁上表現出植物的木質化特征，而組織的木質化又是細胞次生壁形成的主要表現之一[21]。作為木質素合成代謝的重要限速酶之一[22-23]的植物C4H基因的研究范圍較為廣泛，而對榅桲C4H基因的研究尚屬空白。本研究使用RT-PCR 方法克隆獲得榅桲組織C4H基因的編碼區全序列區，序列全長為1 518 bp，編碼505 個氨基酸，該蛋白的相對分子質量為58.28 kD，理論等電點為9.30；榅桲C4H 蛋白中異亮氨酸、纈氨 酸、精氨酸、谷氨酸的含量均較高，為親水性不穩定蛋白質；榅桲的C4H 蛋白屬于混合型結構的蛋白質，其二級結構中以α-螺旋和無規卷曲結構為主；榅桲的C4H基因與甜櫻桃（Prunus avium，XP_021806844.1）、 山 杏（Prunus armeniaca，VVA16404.1）等物種的C4H基因的相似性均達到了90%以上。

本課題組成員在前期研究中發現，榅桲果實木質素的積累主要在發育前期（落花后100 d 之前）完成，榅桲果實在發育過程中木質素呈現出逐漸降低的趨勢。本研究結果表明，C4H基因的表達量與植物木質素的含量關系密切。C4H基因在歐芹木質素含量高的花梗中大量表達，而在其葉片內不表達[24]；C4H基因在擬南芥中也是在木質素積累豐富的部位大量表達[25]。本研究在前期研究的基礎上，初步探索了不同發育時期榅桲果實中C4H基因表達量的差異特點，結果表明，榅桲在果實發育成熟過程中，C4H基因的表達量隨著果實的逐漸發育成熟而降低，說明榅桲果肉的發育成熟程度與C4H基因的表達量表現出負相關的關系。榅桲果實發育過程是一個果肉木質素的積累與果肉木質化的過程，本研究克隆了C4H基因，只對其木質化的分子機理進行了初步探討，而對其C4H 蛋白表達與果肉木質化的關系等方面的研究尚待深入。

4 結 論

榅桲果肉中C4H基因的編碼區序列全長為 1 518 bp，編碼505 個氨基酸，其蛋白分子質量為58.28 kD。生物信息學分析結果表明，榅桲C4H蛋白為親水性不穩定蛋白質，其二級結構以α-螺旋和無規卷曲結構為主。定量PCR 檢測結果顯示，隨著榅桲果實的發育成熟，果肉中C4H基因的表達量逐漸減少，榅桲果肉的發育成熟程度與C4H基因的表達量之間呈負相關關系。