梨果不同部位中熊果苷的差異分布規律

李 凡，羅嘉亮，李六林，郝瑞杰

（山西農業大學 園藝學院，山西 太谷 030801）

梨屬于薔薇科Rosaceae 梨屬Pyrus植物，在世界各地栽培廣泛，中國是東方梨的重要原產地之一，種質資源十分豐富[1]。梨果實肉脆多汁，富含糖類、有機酸、維生素等營養物質和酚類物質[2]。植物中的酚類物質，不僅在植物的生長發育過程中涉及許多生理代謝反應[3]，還會直接影響果實的營養品質[4]和植株的整體抗性[5-6]。袁江等[7]研究發現，酚類物質在不同梨品種間的含量存在很大差 異；Li 等[8]對我國8 個梨品種的酚類物質進行了分析，結果發現，梨果中主要的酚類物質是熊果苷；Li 等[9]對10 個品種梨的酚類物質進行測定后發現，其果皮與果肉中均存在熊果苷。

熊果苷是當今流行的最為安全的美白原料，它能抑制體內酪氨酸酶的活性，阻斷多巴及多巴醌的合成，進而阻止黑色素的形成[10]。李靜等[11]證實了熊果苷是對苯二酚衍生物。梨果具有鎮咳、祛痰、平喘等功用[12-13]，王亞芳等[14]對小鼠飼喂熊果苷的試驗結果證實了梨果中具備上述功用的主要物質是熊果苷。熊果苷是植物體中重要的次生代謝產物，廣泛存在于多種植物的果實[15]、花[16]、莖皮[17]、種子[18]等部位中。但是，目前國內外對梨果中熊果苷的研究尚處于起步階段[19-20]，關于梨果中熊果苷等酚類物質的時空分布規律等方面的研究還未深入。為此，本研究以產自山西省太谷縣的栽培梨品種為材料，利用高效液相色譜法，對不同品種梨果不同部位中熊果苷的含量進行了測定和分析，以期深入了解熊果苷含量在多個梨品種中的分布差異情況，并闡明熊果苷在梨果中的分布規律，從而為熊果苷的開發利用提供參考依據，并為后期梨果中熊果苷代謝機理的研究及育種實踐提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年9月在山西省農業科學院果樹研究所梨種質資源圃采集常規管理的成熟期梨果 實，供試的5 個梨品種分別為‘玉露香’‘庫爾勒’‘黃冠’‘豐水’‘鴨梨’，每個品種各選3 株長勢良好的樹體，在樹冠外圍各采收3 個果實形狀和品質均良好的梨果。本試驗后續處理及測試均在山西農業大學園藝學院進行，每處理各設3 個重復。

1.2 試驗藥品及儀器

試驗藥品：甲醇、乙腈、甲酸、熊果苷標準品均為色譜純，其純度均≥99%，均購自北京索萊寶公司；濃磷酸為分析純；試驗用水為超純水。

試驗儀器：U3000 高效液相色譜儀（Thermo LTQ XL），配備四元流動相泵、二極管陣列檢測器（DAD）、熒光檢測器（FAD）、自動進樣器、Venusil ASB C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱（Agela technologies）；3K30 離心機（Sigma）；Orion Star A 211 pH 測量儀（Thermo Scientific）；超聲波清洗儀；電子天平；漩渦振蕩儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的制備

取熊果苷標準品20 mg，加入1 mL 的色譜級甲醇，配制成20 mg·mL-1的母液。將母液稀釋制備成濃度依次為1 000、500、100、50、30、 10 μg·mL-1的單一標準品溶液（下稱“單標”），各吸取1 mL 存入棕色進樣瓶中，按照色譜條件依次進樣，不使用時將其保存于-20 ℃的溫度條件下。

1.3.2 果實部位及果肉切片部位的選取

參照曹玉芬[21]的方法，分別選取果皮、果肉、果心、果肩（果梗基部）、果頂（萼洼部位）等部位。

果肉切片部位的選取：取去皮去核后的果肉，以果核為中心軸線，圍繞其旋轉1 周，依據梨果膨大程度，按其厚度將果肉均勻劃分為5 個部分，由果皮至果心的橫向方向依次劃為部位I、部位II、部位III、部位IV 和部位V。梨果肉不同部位的俯視示意圖如圖1 所示。

1.3.3 熊果苷的提取

參照曾少敏等[22]提取酚類物質的方法（稍作改進）提取熊果苷。分別將梨果各部位以液氮研磨成粉末后，各精確稱取0.6 g置于10 mL的離心管中，于-40 ℃的溫度條件下保存。液相色譜上樣前，在10 mL 的離心管中加入色譜純的純甲醇4.8 mL、超純水1.2 mL，漩渦振蕩充分混勻，常溫超聲15 min后靜置，以5 000 r·min-1的轉速于4 ℃的溫度條件下離心20 min，取上清液過0.22 μm 的有機相濾膜，取1 mL 過濾液存入棕色進樣瓶中以待測。

圖1 梨果果肉不同切片部位的俯視示意圖Fig.1 Overlooking diagram of different parts in pear fruit

1.3.4 高效液相色譜條件的設定

參照孔祥虹等[23]的方法（稍作改進）設定高效液相色譜條件。流動相分別為乙腈（A）和0.5%的甲酸水（B），其梯度洗脫程序見表1。自動進樣器流速設為0.8 mL·min-1；柱溫控制為30 ℃；測定波長為280 nm，波長精度為（±0.1）nm；進樣量為20 μL，程序運行時間為69 min。

1.4 數據處理及分析

分別利用SAS 8.1 和Microsoft Excel 2013 軟件對數據進行處理分析和作圖。

表1 流動相梯度洗脫程序（VA∶VB）Table 1 Gradient elution procedure with mobile phases (VA∶VB)

2 結果與分析

2.1 熊果苷標準曲線的建立

將配制好的濃度梯度分別為10、30、50、100、500、1 000 μg·mL-1的單標按照已經確立的色譜條件分別進樣，根據色譜圖的結果選擇熊果苷標準物質含量的峰面積進行線性回歸分析，強制過原點后得到的熊果苷含量（μg·mL-1）與峰面積的線性方程（y=0.073 7x，R2=0.992 4）如圖2所示。熊果苷的出峰時間是5.823 min，如圖3 所示。樣品中熊果苷的含量以外標法定量，將測定結果換算后以每克鮮樣所含熊果苷的微克數表示，單位為μg·g-1。

圖2 熊果苷的標準曲線圖Fig.2 Standard curve of arbutin

2.2 不同品種梨果果皮、果肉、果心中熊果苷的含量分析

對供試的5 個梨品種成熟期果實果皮、果肉、果心中熊果苷的含量進行了高效液相色譜分析，結果如圖4 所示。各品種梨果果皮中熊果苷的含量為171.51 ～872.23 μg·g-1，‘玉 露香’‘庫爾勒’‘黃冠’‘豐水’‘鴨梨’果皮中熊果苷的含量分別為872.23、416.19、171.51、289.51、364.45 μg·g-1；各品種間果皮中熊果苷的含量存在差異，‘玉露香’果皮中熊果苷的含量較高，與其它品種間的差異顯著。各品種梨果果肉中熊果苷的含量為2.17 ～12.94 μg·g-1，‘玉露香’‘庫爾勒’‘黃冠’‘豐水’‘鴨梨’果肉中熊果苷的含量分別為7.69、2.17、9.18、10.31、 12.94 μg·g-1；各品種間果肉中熊果苷的含量存在差異，‘庫爾勒’果肉中熊果苷的含量較低，‘庫爾勒’與‘玉露香’‘黃冠’間其含量差異均不顯著，而與‘豐水’‘鴨梨’間其含量差異均顯著；但‘玉露香’和‘黃冠’之間無差異，‘豐水’和‘鴨梨’之間也無差異。各品種梨果果心中熊果苷的含量為74.45 ～268.20 μg·g-1，‘玉露香’‘庫爾勒’‘黃冠’‘豐水’‘鴨梨’果心中熊果苷的含量分別為150.93、74.45、130.44、117.87、268.20 μg·g-1；其中，‘鴨梨’果心中熊果苷的含量較高，與其它品種間的含量差異顯著；除‘鴨梨’外，其余品種間的含量無顯著性差異。由圖4 可知，對同一品種進行橫向比較，果皮、果肉、果心中熊果苷的含量存在顯著性差異，果皮中熊果苷的含量最高，果心次之，果肉中熊果苷的含量最低。果皮與果肉中熊果苷的含量相差較大；在供試的 5 個品種中，‘庫爾勒’果皮與果肉中熊果苷的含量差值最大，其果皮中熊果苷的含量是其果肉中的191.79 倍；而‘黃冠’果皮與果肉中熊果苷的含量差值較小，其果皮中熊果苷的含量是其果肉中的18.68 倍；各品種果皮中熊果苷的含量是其果心中的1.31 ～5.78 倍，‘玉露香’的含量倍數最高，而‘黃冠’的含量倍數最低。

圖3 熊果苷的色譜圖Fig.3 Chromatogram map of arbutin

圖4 不同品種梨果果皮、果肉、果心中熊果苷的含量比較Fig.4 Comparison of arbutin contents in peel, pulp and core of different cultivars of pear fruits

2.3 不同品種梨果果肩和果頂中熊果苷的含量分析

對供試的5 個梨品種成熟期果實果肩和果頂中熊果苷的含量進行了高效液相色譜分析，結果如圖5 所示。5 個品種梨果果肩中熊果苷的含量為34.96 ～169.74 μg·g-1，‘玉露香’‘庫爾勒’‘黃冠’‘豐水’‘鴨梨’果肩中熊果苷的含量分別為169.74、65.67、34.96、137.40、77.25 μg·g-1； 5 個品種梨果果頂中熊果苷的含量為35.41 ～ 123.34 μg·g-1，‘玉露香’‘庫爾勒’‘黃冠’‘豐 水’‘鴨梨’果頂中熊果苷的含量分別為123.34、73.04、35.41、42.97、94.21 μg·g-1。縱向比較同一品種梨果果肩和果頂中的熊果苷含量后發現，‘玉露香’和‘豐水’果肩中熊果苷的含量均高于其果頂中的含量，其中，‘玉露香’果肩中的熊果苷含量是其果頂中的1.38 倍，‘豐水’果肩中的熊果苷含量是其果頂中的3.20 倍；而‘庫爾勒’‘黃冠’和‘鴨梨’果肩中的熊果苷含量均低于其果頂中的含量，其果頂中的熊果苷含量分別是其果肩中的1.11、1.01、1.22 倍。顯著性差異分析結果表明，‘豐水’果肩和果頂兩個部位間其熊果苷含量存在差異，除‘豐水’外其余各品種間果肩和果頂中的熊果苷含量均無顯著性差異。

圖5 不同品種梨果果肩和果頂中熊果苷的含量比較Fig.5 Comparison of arbutin contents in shoulder and top parts of different cultivars of pear fruits

2.4 梨果果肉不同切片部位中熊果苷的含量分析

將供試的5 個品種成熟期梨果果肉分別切分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ5 個部位后對其進行高效液相色譜分析，結果如圖6 所示。‘玉露香’果肉的 5 個切片部位的熊果苷含量為3.44 ～17.96 μg·g-1， 其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部位的熊果苷含量分別為17.96、3.44、4.43、17.59、9.54 μg·g-1；各個切片部位間無顯著性差異。‘庫爾勒’果肉的5 個切片部位的熊果苷含量 為34.92 ～105.65 μg·g-1，其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部位的熊果苷含量分別為105.65、58.57、34.92、42.02、67.30 μg·g-1；除Ⅰ與Ⅲ、Ⅳ部位間均有顯著性差異外，其余各個切片部位間無顯著性差異。‘黃冠’果肉的5 個切片部位的熊果苷含量為16.28 ～46.36 μg·g-1，其 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部位的熊果苷含量分別為46.36、16.28、20.44、22.39、42.33 μg·g-1；除Ⅰ和 Ⅴ、Ⅱ部位間均有顯著性差異外，其余各個切片部位間無顯著性差異。‘豐水’果肉的5 個切片部位的熊果苷含量為32.79 ～73.81 μg·g-1，其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部位的熊果苷含量分別67.80、32.79、73.81、34.92、37.99 μg·g-1；Ⅲ與Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ部位之間及部位Ⅰ與Ⅱ、Ⅳ部位之間均有顯著性差異，其余各個切片部位間無顯著性差異。‘鴨梨’果肉的5 個切片部位的熊果苷含量為37.04 ～ 105.47 μg·g-1，其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部位的熊果苷含量分別為105.47、73.27、37.04、55.54、53.46 μg·g-1；部位Ⅰ與其余4 個切片部位之間及部位Ⅱ與Ⅲ之間均有顯著性差異，而其余各個切片部位間無顯著性差異。熊果苷在梨果肉內廣泛存在，從其各個切片部位中均可檢測到，供試的 5 個梨品種中，‘玉露香’果肉5 個切片部位的熊果苷含量之間無顯著性差異，除‘玉露香’外的其余4 個品種5 個切片部位間其含量均存在差異，但是，各品種梨果果肉中熊果苷含量較高的切片部位均為部位Ⅰ。

圖6 不同品種梨果果肉不同切片部位的熊果苷含量比較Fig.6 Comparison of arbutin contents in different positions of pear pulp sections from different cultivars

3 結論與討論

最近幾年有關熊果苷的研究日益被關注，因為熊果苷具有鎮咳、美白等功效[24]，是梨果實中含量較高的酚類物質[19]。馬良[25]對不同梨品種進行研究后指出，白梨果實中酚類物質含量最高的是熊果苷；韓凱[26]對四大系統不同梨品種的熊果苷進行測定后指出，白梨果實中熊果苷含量普遍較高，而白梨系統不同品種間梨果實中的熊果苷含量具有顯著性差異；曾少敏等[27]對不同梨品種的熊果苷進行測定后發現，白梨系統果皮中熊果苷的平均含量顯著高于其它系統。本研究結果表明，供試的5 個梨品種間其熊果苷含量也存在顯著性差異，屬于白梨系統的‘玉露香’‘庫爾勒’[28]和‘鴨梨’果皮中的熊果苷含量均顯著高于屬于砂梨系統的‘豐水’果皮中的含量，這與馬良、曾少敏和韓凱的研究結果均一致。白梨系統的品種是北方主栽梨品種，研究白梨系統對我國梨樹栽培具有重大經濟意義[29]。

張小雙等[30]對梨果不同部位中的熊果苷進行檢測后發現，其含量差異顯著；李浩男等[31]在對梨成熟期果皮的研究中發現，梨果皮中主要的酚類化合物是熊果苷；Escarpa 等[15]將5 個西洋梨分為果皮和果肉兩個部位進行研究，結果發現，兩個部位中的熊果苷含量，果皮顯著高于果肉；李麗梅等[32]對北方主栽梨品種進行測定后指出，3 個部位中的熊果苷含量，果皮高于果肉和果心。本研究將梨果分為果皮、果肉、果心、果肩、果頂5 個部位進行研究，結果表明，果皮是熊果苷含量最高的部位，這與張小雙、Escarpa 和李麗梅的研究結果均一致。研究中還發現，果皮中熊果苷含量高的梨品種，其果肉和果心中熊果苷的含量相對較低，如‘玉露香’和‘庫爾勒’；而果皮中熊果苷含量低的梨品種，其果肉和果心中熊果苷的含量則相對較高，如‘黃冠’和‘鴨梨’。郭靜等[33]研究指出，熊果苷易溶于水，由此推測，出現此類結果的原因可能與熊果苷的運輸有關，熊果苷在梨樹體內合成后，因其溶解性可能會造成隨著水分的運輸而表現出分布不均勻的現象。供試的果肉、果肩、果頂同為去皮去核的梨果肉，比較同一品種這3 個部位中的熊果苷含量可發現，果肉較果肩和果頂低，結合熊果苷含量最高的部位是梨果皮這一結果可以推測，由于梨果皮存在的蒸發現象[34]，所以存在于梨果實內的熊果苷，更有可能向梨果外緣富集，因此，同在外緣區域的果肩、果頂也有可能都會出現熊果苷含量較高的現象。

對供試的5 個梨品種果肉的5 個切片部位進行了高效液相色譜分析，研究了熊果苷在梨果肉中的分布規律。結果表明，‘玉露香’梨果果肉 5 個切片部位間其熊果苷含量無顯著性差異，即熊果苷在‘玉露香’梨果肉中的分布均勻。不同于果皮與果心的是，梨果肉屬于結構相似的薄壁組織[35]，梨果在膨大期通過快速吸水以實現體積重量的增大[36]，這種結構相似的均一性與熊果苷在梨果肉內分布均勻之間存在著直接的關系，但是，目前梨果內熊果苷的生物合成仍未得到闡明。除‘玉露香’外，其余4 個梨品種熊果苷含量較高的切片部位均為部位Ⅰ，因為部位Ⅰ靠近果皮，可能受到了果皮中熊果苷含量高的影響。

熊果苷廣泛存在于梨果內，供試的5 個梨品種均富含熊果苷這一酚類物質，且各品種間其含量存在差異，‘玉露香’梨果中的熊果苷含量最高；同一品種各部位間其含量也存在差異：橫向比較可知，果皮中的熊果苷含量最高，果心次之，果肉最低；縱向比較可知，果肩和果頂中的熊果苷含量相近。對梨果肉的切片分析結果表明：‘玉露香’梨果肉5 個切片部位間其熊果苷含量無明顯差異，說明熊果苷在其果肉中的分布均勻且不同切片部位間其含量相差較小；除‘玉露香’外的其余梨品種，熊果苷含量最高的切片部位均為靠近果皮的位置。總之，熊果苷的多種功效及其在植物中的廣泛存在值得在生產中加以開發和利用。本研究闡明了成熟期梨果不同部位中熊果苷的差異分布規律，后續研究將進一步探尋不同生育期梨果內熊果苷含量的節律變化特點，并結合梨果實發育轉錄組學，揭示熊果苷的生物合成及富集機理。