凡納濱對蝦多酚氧化酶的純化鑒定與生物信息學分析

魏 帥，劉 媛，劉蒙娜，孫欽秀，劉書成，吉宏武，郝記明，鄧楚津，毛偉杰

凡納濱對蝦多酚氧化酶的純化鑒定與生物信息學分析

魏 帥，劉 媛，劉蒙娜，孫欽秀，劉書成，吉宏武，郝記明，鄧楚津，毛偉杰

（1. 廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋食品工程技術研發中心，廣東省海洋生物制品工程重點實驗室，水產品深加工廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524088；2. 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，大連工業大學，遼寧 大連 116034；3. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室（湛江），廣東 湛江 524088）

【目的】從凡納濱對蝦（）中分離純化多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO），進行質譜鑒定，分析其生物學信息。【方法】采用硫酸銨沉淀結合柱層析法從蝦頭胸部中提取純化PPO，電泳法確定其分子質量，采用液相質譜聯用法分析氨基酸序列結構，根據分析結果，同源建模并進行評估。【結果與結論】獲得了高純度的PPO，其純化倍數為65.7，酶比活力達650.1 U/mg蛋白，得率為29.5%。PPO分子質量約為72 ku。經質譜檢測分析和basic local alignment search tool（BLAST）序列比對，純化蛋白與凡納濱對蝦酚氧化酶原的氨基酸序列相似性為65%，匹配度分值為11 321，確認為PPO。PPO是一種親水性大于疏水性的兩性蛋白，二級結構以α-螺旋和無規則卷曲為主，建立的PPO三維結構模型可靠性較高。

凡納濱對蝦；多酚氧化酶；質譜；鑒定；生物信息學

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是動植物和真菌體內廣泛存在的一種酶，分為單酚單氧化酶（酪氨酸酶tyrosinase，EC.1.14.18.1）、雙酚氧化酶（兒茶酚氧化酶catechol oxidse，EC.1.10.3.2）與漆酶（laccase，EC.1.10.3.1）[1]。PPO可催化單酚羥基化形成二元酚及二元酚氧化成鄰醌類[2]。通常PPO以酚氧化酶原（Propolyphenoloxidase，proPPO）形式存在，不具催化活性，但與模式識別蛋白、絲氨酸蛋白酶等一同構成復雜的proPPO激活系統。在生物體受到損傷或死亡后，一些外源多糖與模式識別蛋白結合，會激活proPPO生成PPO[3-5]。Cu2+結合區為PPO的主要功能區，N-端導肽和和C-端疏水區對酶的構象、高級結構的形成和維持起作用[1]。Cu2+結合區富含組氨酸（His）殘基，每個Cu2+與3個His殘基以配位鍵相連，形成了具有特定三維結構的活性部位[6]。

蝦類捕獲后如果未及時處理或處理不當，在后續的貯藏與加工過程中易發生黑變，尤其是在蝦體頭部、胸部以及尾部和關節處，這是由于PPO催化單酚生成二酚，氧化生無色醌類物質，在非酶促反應下聚合生成黑色素，導致蝦黑變[7]。蝦體黑變一旦發生就很難去除，雖然對蝦營養價值影響較小，但對蝦感官品質和商品價值影響較大，影響其市場銷售和經濟效益[8-9]。低溫貯藏等手段可以在一定程度上保持蝦的品質，延長貯藏期，但黑變問題仍然存在，需聯合其它可能的手段進行控制[10]，蝦類黑變已成為目前限制蝦類保鮮與加工的重要瓶頸技術問題之一。本研究從凡納濱對蝦出分離出高純度PPO，分析其分子結構和理化特性以及分子生物學信息，以期根據其結構特點采用針對性處理降低其酶活或鈍化，進而為研究控制對蝦黑變技術提供相應基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凡納濱對蝦購于廣東湛江市霞山區東風水產批發市場，選取質量均一〔（15±0.5）g〕鮮活蝦，充氧保活運至實驗室，自來水清洗后加冰猝死，立即取蝦頭胸部用于PPO提取。

聚氧乙烯月桂醚和左旋多巴胺[3-(3,4-Dihydroxyphenyl)--alanine,-DOPA]購于美國Sigma公司，三羥甲基氨基甲烷購于上海麥克林生化科技有限公司，Q Sepharose Fast Flow和Superdex 200填料購于通用電氣（中國）有限公司，二辛可寧酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白質含量測定試劑盒、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS-PAGE）配制試劑盒、非變性PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、考馬斯亮藍染色液購于上海碧云天生物技術有限公司，標準蛋白（Marker）購于廣州鼎國生物科技有限公司，乙腈購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 儀器設備

DLSB-10/20型低溫冷卻液循環泵（成都一科儀器設備有限公司），Cary 60型紫外可見分光光度計（安捷倫科技有限公司），Thermo Lynx 6000型高速落地離心機、Varioskan Flash型全自動酶標儀、Q-EXACTIVE型串聯ESI質譜儀〔賽默飛世爾科技（中國）限公司〕，HH?S21-8-S型電熱恒溫水浴鍋（上海圣科儀器設備有限公司），AKTA purifier 100型制備型蛋白質純化系統〔通用電氣（中國）公司〕，組織勻漿機（九陽股份有限公司），SLI-700型恒溫培養箱（上海愛朗儀器有限公司），基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（德國布魯克公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 PPO分離純化 PPO粗酶液的提取參考Nirmal等[11]法。稱取新鮮凡納濱對蝦頭胸部850 g，添加2 550 g磷酸鹽緩沖液，搗碎勻漿靜置3 h；離心后取上清液，添加固體硫酸銨至飽和度40 %，靜置30 min；離心，沉淀溶于磷酸鹽緩沖液中透析18 h，離心得到清液即為PPO液體，-70℃儲存備用（以上操作均在4 ℃條件下進行）。

采用離子交換層析進行粗酶液純化，參考Fan等[12]法。將45 mL粗酶液上樣于Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱（2.6 cm × 30 cm），用Tris-HCl溶液洗脫，測定PPO酶活和蛋白質含量。凝膠層析時取上一步收集的PPO組分3 mL，上樣于經平衡的Superdex 200凝膠層析柱（1.6 cm×70 cm），緩沖液洗脫時流速設為1 mL/min，收集洗脫液，每管2 mL，測定PPO酶活和蛋白質含量。合并高PPO活性的洗脫液，測總活力和總蛋白，用超濾管濃縮，-20 ℃儲存備用。

1.3.2 PPO酶活力測定 參考黃萬有等[13]法，取100 μL PPO液體加入400 μL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0），加入600 μL 15 mmol/L L-DOPA溶液，45 ℃水浴反應3 min，檢測光密度。用100 μL去離子水為空白對照。酶活定義：每分鐘每毫升的酶在475 nm下光密度值每增加0.001為1 U，單位：U?min-1?mL-1。

PPO酶活力=（1-2）/（×）×1000，

其中，1為PPO的光密度值；2為空白對照的光密度值；為反應時間，min；為酶液的體積，mL。

1.3.3 蛋白質含量測定 以BSA標準品作為標準蛋白，96孔板中分別加入20 μL質量濃度0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 mg/mL標準品，加入200 μL BCA工作試劑。取20 μL樣品，加入200 μL BCA，60 ℃下孵育30 min，用酶標儀在562 nm波長下測其最大光密度值，繪制標準曲線，計算樣品蛋白質含量。

1.3.4 電泳分析 將純化的PPO濃縮液，采用SDS-PAGE檢測分子質量。SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）與樣品以1∶4的比例上樣15 μL，上樣量為50 μg，電泳完畢后，以考馬斯亮藍染色液染色膠條。采用Native-PAGE電泳檢測其活性。分離膠和濃縮膠的體積分數分別為12%和5%，非變性PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）與樣品以體積比1∶4的比例上樣15 μL，上樣量為50 μg，含樣品的上樣液未經煮沸，電泳完畢后，用15 mmol/L L-DOPA溶液染色膠條。

1.3.5 質譜分析 將含PPO的SDS-PAGE膠條切下，進行Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry（MALDI-TOF-MS）分析和Liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry（LC-ESI- MS/MS）分析，Mascot及BLAST數據庫檢索比對氨基酸序列。

1.3.6 PPO生物信息學分析 根據測得的PPO氨基酸序列，采用Expasy站點分析預測PPO生物學信息[14]，采用ProtParam分析PPO氨基酸組成和特性、ProtScale分析疏水性、GOR和predictprotein seartificial預測二級結構。用BLAST程序在蛋白質結構數據庫Protein Data Bank（PDB）中搜索同源蛋白，采用SWISS-MODEL工作站進行三維結構同源建模，并在該工作站對建模結果進行評估。

1.4 統計分析

每個實驗重復3次，數據用“平均值±標準差”表示；采用Excel進行方差分析和作圖，生物信息學分析相關數據從各工作站讀取。

2 結果與討論

2.1 PPO的分離純化

對粗酶液進行Q Sepharose Fast Flow離子交換柱層析，可較好分離PPO粗酶液，選取PPO活性較高的收集液進行凝膠層析柱分離。選取PPO酶活力和蛋白質含量都較高的收集液進行再次Q Sepharose Fast Flow離子交換柱層析，獲取更高純度的PPO，以PPO酶活最高的洗脫液進行實驗，結果見圖1。

A為凝膠層析分離圖，B為凝膠層析洗脫液的酶活和蛋白質質量濃度（2 mL/管）； C為離子交換層析分離圖，D為離子交換洗脫液的酶活和蛋白質質量濃度（5 mL/管）

A means the separation chromatogram using superdex 200, B means the enzyme activity and protein content of the elution (2 mL/tube) using superdex 200; C means the ion exchange separation chromatogram, D means the enzyme activity and protein content of the elution (5 mL/tube) using ion exchange separation

圖1 多酚氧化酶PPO凝膠層析譜圖和離子交換柱層析圖譜

Fig. 1 The separation chromatography using superdex 200 and ion exchange separation chromatography of PPO

凡納濱對蝦PPO粗酶液純化結果見表1，純化倍數達到65.7，酶比活力大大提高，達到650.1 U/mg蛋白。Chen等[15]用硫酸銨沉淀和和高效疏水性色譜柱純化粉紅蝦和白對蝦的PPO，純化倍數為50，酶比活力為100 U/mg蛋白；用丁醇處理和高效疏水性色譜柱純化粉紅蝦和白對蝦的PPO，純化倍數為200，酶比活力在320 U/mg蛋白以上。Rolle等[16]用硫酸銨沉淀和高效疏水性色譜柱（苯基瓊脂糖CL-4B）純化斑節對蝦的PPO，純化倍數和酶比活力為58和1.33 U/mg蛋白。樊廷俊等[17]用Sephacryl S-100凝膠柱和Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱純化中國對蝦的PPO，純度達到30.2，酶比活力達258.0 U/mg蛋白。蝦類PPO純化方法較多，但其純化效果不同，產生差異原因可能是由于PPO中酚類化合物濃度和類型不同影響了PPO與其他蛋白質的整體結合，目前已發現PPO-蛋白質會干擾蛋白質的純化，該酶中所含的離子和疏水特性因與酚類物質的結合而隨之改變，這也導致純化過程中需選擇不同的洗脫方式[18]。

表1 凡納濱對蝦中多酚氧化酶PPO純化

注：比活力 = 總活力/總蛋白質量，純化倍數 = 各步驟分離組比活力/粗酶液比活力；得率 = 各步驟分離組分總活力/粗酶液總活力。

Note：Specific activity =total activity /total protein, purification fold = specific activity of each separation step / specific activity of crude extract; yield = total activity of each separation step / total activity of crude extract.

另外，不同品種蝦PPO活性以及提取過程所攜帶雜質存在差異，各純化方法效率也存在差異，所得到PPO純度也不相同。

2.2 PPO分子質量

純化后PPO的SDS-PAGE和Native-PAGE電泳圖譜如圖2所示，SDS-PAGE電泳中PPO在72 ku處有條帶，經LC-MS/MS質譜鑒定，該條帶為PPO。Native-PAGE電泳中PPO在210 ku處顯示條帶，與Nirmal等[8]實驗結果一致。PPO分子質量大小依據電泳形式的不同而有所變化，此類蛋白以多聚體形式存在，尤其是在Native-PAGE中，而SDS-PAGE中因所帶電荷不同引起的遷移率不一使分子質量分散且有所降低[19]。單個PPO亞基多為低分子質量，分別有71 ku[20]、40 ku[21]、97 ku、88 ku和82 ku[15]，甲殼動物的PPO由于表面帶電基團較少易形成聚集體[22]。PPO基因有兩個區域，一是與銅離子有關的編碼區，另一個是引導肽，PPO酶原含有引導肽，酶原去除引導肽后變成有活性的成熟PPO，不同品種蝦中的引導肽分子質量不一致，導致PPO分子質量不同[23]。

2.3 PPO的質譜分析

SDS-PAGE膠上蛋白經MALDI-TOF-MS分析，確定72 ku處條帶為PPO，為精確鑒定出所純化PPO的氨基酸序列，進一步采用了LC-ESI-MS/MS進行分析。酶解后的膠上蛋白以多肽片段形式進入LC-ESI-MS/MS進行分析，確定有質譜信號，經Mascot數據庫檢索后鑒定出PPO，其蛋白質得分與蛋白中所含肽段得分結果見圖3。匹配分值的計算方法為-10 lg，值為蛋白可以隨機匹配的概率，根據Mascot評分判斷（< 0.05），匹配值大于45時有統計學意義，根據此得分的蛋白質鑒定結果可信[24]。選擇一級質譜中信噪比大于10的肽段進行LC-MS/MS分析，二級質譜結果共有26個肽段含455個氨基酸殘基。將分析結果與BLAST數據庫中氨基酸序列進行對比，與凡納濱對蝦的酚氧化酶原（序列號ABQ45957，分子質量為78.985 ku）的序列相似性為65 %，匹配度分值為11 321，等電點為6.05，氨基酸殘基比對結果見圖4。

M，標準蛋白，ku；1，PPO的SDS-PAGE電泳條帶；2，PPO的Native-PAGE電泳條帶。

圖3 經LC-MS/MS分析后得到的Mascot檢索

Fig .3 Mascot result of PPO from SDS-PAGE after LC-MS/MS

灰色背景字母為比對上的氨基酸殘基

2.4 PPO的理化特性分析

利用ExPASy站點的ProtParam程序對PPO的氨基酸組成進行分析，分析結果如圖5所示。PPO中含量最多的氨基酸為亮氨酸（Leu，9.4%），其次為精氨酸（Arg，7.5%）、天冬氨酸（Asp，7.5%）和纈氨酸（Val，7.1%）。對PPO活性中心起重要作用的組氨酸（His）和半胱氨酸（Cys）含量分別為3.6 %和0.7 %。PPO中疏水性氨基酸含量為43.4 %，分別為亮氨酸（Leu，9.4 %）、纈氨酸（Val，7.1 %）、丙氨酸（Ala，6.5 %）、脯氨酸(Pro，6.2 %)、苯丙氨酸（Phe，5.8 %）、蛋氨酸（Met，3.2 %）、異亮氨酸（Ile，3.8 %）和色氨酸（Trp，1.4 %）。親水性最強的兩種氨基酸為精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys），分別占7.5 %和4.1 %對PPO的理化特性進行分析（表2），不穩定指數是對蛋白質在實驗中的穩定性評估，通常蛋白質的不穩定系數大于40時為不穩定蛋白，小于40時為穩定蛋白[25]，PPO為不穩定蛋白。脂肪系數為脂肪族側鏈所占的相對體積，該值被認為可能與提高球蛋白熱穩定性有關，也可表征蛋白質的疏水性，數值越大表明疏水性越強[26]，PPO的脂肪系數為78。平均親水系數可用于表征蛋白質的疏水性，其范圍一般在2與-2之間，大于0時為疏水蛋白，小于0時為親水蛋白[27]。從表2可以看出，PPO既具有一定的親水性，又具有一定疏水性，是一種兩性蛋白。

圖5 多酚氧化酶PPO的氨基酸組成分析

表2 多酚氧化酶PPO的理化特性

利用ExPASy中的ProtScale網站對PPO進一步作疏水性分析，氨基酸標度值為賦予每種類型氨基酸的數值。最常用的量表是疏水性或親水性量表。Hphob./Kyte & Doolittle量表規定疏水性越強的氨基酸標度值越高，當蛋白質的氨基酸標度值大于0時為疏水性蛋白，小于0時為親水性蛋白[25]。從圖6可看出，PPO評分值既有正值也有負值，但稍偏向負值，PPO親水性大于疏水性。

2.5 PPO的二級結構預測

蛋白質常見的二級結構主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲等，它們是構成蛋白質三級結構的基本元素。利用PredictProtein seartificial和ExPASy中的GOR網站分別對凡納濱對蝦PPO二級結構進行預測。PredictProtein seartificial對二級結構的預測是以蛋白質的神經網絡為依據，預期平均精度超過72%[28]。GOR算法以信息論為基礎，同時考慮被預測位置氨基酸殘基種類對該位置構象的影響及相鄰殘基種類對該位置構象的影響兩個方面，物理意義清楚明確，數學表達嚴格，預測的成功率也在70%以上[29]。

縱坐標為氨基酸的標度值

PredictProtein seartificial預測PPO的二級結構主要是以卷曲形式（61.36%）和螺旋形式（24.89%）為主，折疊結構為13.75%，埋藏內部（51.23%）的氨基酸殘基稍多于暴露表面（37.48%）的氨基酸殘基。GOR預測PPO二級結構中α-螺旋結構占33.29%，β-折疊結構占15.92%，無規卷曲結構占50.8%。兩種結構預測方法數據存在差異，但總體趨勢是一致的，說明PPO是以卷曲和螺旋結構為主的一種蛋白質。預測的PPO二級結構種類和含量與凡納濱對蝦多酚氧化酶酶原的一致，這也說明了凡納濱對蝦proPPO與PPO在二級結構上是相似的。

2.6 PPO三維結構預測

將PPO序列在predictprotein結構預測軟件進行相似性搜索，蛋白序列數為93，與PDB中結構的匹配數為31。蛋白同源性分析得到PPO假定保守域，含功能結構域血藍蛋白-N、血藍蛋白-M和血藍蛋白-C，其中以血藍蛋白-N和血藍蛋白-C為主，同源性蛋白信息見表3，其中煙草天蛾酚氧化酶原晶體結構與PPO的同源性最高，達40%，蛋白編號為3HHS_B。

利用SWISS-MODEL工作站，以SMTL ID為3HHS.1的B鏈為模板進行建模，3HHS.1 B鏈與實驗中凡納濱對蝦PPO序列具有40.36 %的一致性，氨基酸序列號覆蓋范圍為3 ~ 689，覆蓋率為99%，滿足同源建模同源性要求25% ~ 30%的標準。對PPO進行同源建模，其三維模型見圖7。PPO三維結構中含4個配體，2個Cu2+單體（也為保守結合位點），配體3與鏈B H369、H373、F405、H409相連，配體4與鏈B H209、H213、H235相連，配體3和4無保守結合位點。

表3 多酚氧化酶PPO同源性蛋白分析結果

圖7 SWISS-MODEL建模的PPO三維結構

對PPO的三維結構模型進行評估，包括整體模型質量評估（Global Model Quality Estimation，GMQE）、復合評分函數值（Qualitative Model Energy Analysis，QMEAN）、整體質量（Global Quality）、局部質量評估（Local Quality）和結構對比（Comparison）等，結果見圖8。

A，局部質量評估；B，與PDB中非重復部分的對比

PPO三維結構模型的GMQE值為0.73，表明模型精度較高。PPO三維結構模型的QMEAN值為-3.17，且有“大拇指向上”標志，表明模型結構與類似結構之間有較好的一致性。數值為-4.0或以下表明模型質量非常低，分數旁邊的“大拇指向上”符號會變為“向下”以強調。Local Quality表示模型的蛋白質長度（軸，以氨基酸計）與結構相似性（軸）之間的關系。通常顯示分數低于0.6的殘差預期質量很低，圖8-A可以看出PPO三維結構模型殘差質量較好。Comparison表示與高分辨率晶體結構得到的分數相比，軸為蛋白質長度（以氨基酸計），軸為歸一化的QMEAN得分，每個點代表一個蛋白質結構。最黑的點表示QMEAN得分為-1和1之間的結構，|-Score | 1到2之間是灰色的，|-Score | 超過2為淺灰色，紅星代表本模型。由圖8-B得本模型的|-Score | 超過2。綜合評估PPO三維結構模型具有較高可靠性。

3 結論

采用硫酸銨沉淀結合柱層析從凡納濱對蝦中提取并純化到高純度、高比活力PPO，得率為29.5%。經SDS-PAGE電泳分析，純化PPO的分子質量為72 ku左右，LC-MS/MS進行鑒定，所得結果與數據庫比較發現，與凡納濱對蝦的酚氧化酶原序列相似性為65%，匹配度分值為11 321。進一步對PPO進行生物信息學分析，發現其為兩性蛋白，親水性大于疏水性。PPO的二級結構以α-螺旋和無規則卷曲為主，在SWISS-MODEL工作站中建立了PPO三維結構模型，并對模型進行分析，確認建模結構可靠性較高。研究結果為對蝦采取合理高效措施以防止和控制黑變提供了理論依據和研究基礎。

[1] 王曼玲, 胡中立, 周明全, 等. 植物多酚氧化酶的研究進展[J]. 植物學通報, 2005, 22(2): 215-222.

[2]GARCIA-MOLINA F, PENALVER M J, RODRIGUEZ-LOPEZ J N, et al. Enzymatic method with polyphenol oxidase for the determination of cysteine and N-acetylcysteine[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(16): 6183-6189.

[3] GóMEZ-GUILLéN M C, MARTíNEZ-ALVAREZ ó, LLAMAS A, et al. Melanosis inhibition and SO2residual levels in shrimps () after different sulfite-based treatments[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture, 2005, 85(7):1143-1148.

[4] NIRMAL N P, BENJAKUL S. Inhibition of melanosis formation in Pacific white shrimp by the extract of lead () seed[J]. Food Chemistry, 2011, 128(2): 427-432.

[5] 劉蒙娜, 劉媛, 劉書成, 等. 3種巰基化合物對凡納濱對蝦多酚氧化酶的抑制效果和動力學[J]. 廣東海洋大學學報, 2017, 37(3): 67-72.

[6] SHI C H, DAI Y, XU X L, et al. The purification of polyphenol oxidase from tobacco[J]. Protein Expression and Purification, 2002, 24(1): 51-55.

[7] GARCI?A-CARREN?O F L, COTA K, NAVARRETE DEL TORO M A. Phenoloxidase activity of hemocyanin in white leg shrimp: conversion, characterization of catalytic properties, and role in postmortem melanosis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(15): 6454-6459.

[8] 陳勝軍, 陶飛燕, 潘創, 等. 蝦產品低溫貯藏保鮮技術研究進展[J]. 中國漁業質量與標準, 2020, 10(1): 68-75

[9] 錢韻芳, 謝晶, 吳文惠. 蝦類保藏過程中酚氧化酶酶促黑變作用機理及其抑制方法的研究進展[J]. 食品工業科技, 2012, 33(22): 400-405

[10] 施佩影, 李仁偉, 劉文營. 不同貯藏溫度對南美白對蝦黑變的影響[J]. 湖州師范學院學報, 2014, 36(8): 35-39.

[11] NIRMAL N P, BENJAKUL S. Biochemical properties of polyphenoloxidase from the cephalothorax of Pacific white shrimp ()[J]. International Aquatic Research, 2012, 4(1): 1-13

[12] FAN T J, JING Z, FAN X Y, et al. Purification and characterization of phenoloxidase from brine shrimp Artemia sinica[J]. Acta Biochimica et Biophys Sinica, 2011, 43(9): 722-728.

[13] 黃萬有, 吉宏武, 劉書成, 等. 凡納濱對蝦PPO的組織分布和活性與其貯藏過程中黑變的關系[J]. 現代食品科技, 2014, 30(2): 89-94.

[14] 付友, 高謙, 文春根, 等. 鯉JAK2基因分子克隆及組織表達分析[J]. 廣東海洋大學學報, 2015, 35(1): 8-17.

[15] CHEN J, CHAREST D J, MARSHALL M R, et al. Comparison of two treatment methods on the purification of shrimp polyphenol oxidase[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture, 1997, 75(1):12-18.

[16] ROLLE R S, GUIZANI N, CHEN J S, et al. Purification and characterization of phenoloxidase isoforms from Taiwanese black tiger shrimp ()[J]. Journal of Food Biochemistry, 1991, 15(1): 17-32.

[17] 樊廷俊, 汪小鋒. 中國對蝦()酚氧化酶的分離純化及其部分生物化學性質[J]. 生物化學與生物物理學報, 2002, 34(5):589-594.

[18] MAYER A M, HAREL E. Polyphenol oxidases in plants[J]. Phytochemistry, 1979, 18(2): 193-215.

[19]ZAMORANO J P, MARTíNEZ-áLVAREZ O, MONTERO P, et al. Characterisation and tissue distribution of polyphenol oxidase of deepwater pink shrimp ()[J]. Food Chemistry, 2009, 112(1): 104-111.

[20]JAENICKE E, DECKER H. Tyrosinases from crustaceans form hexamers[J]. The Biochemical Journal, 2003, 371(Pt 2): 515-523.

[21] SIMPSON B K, MARSHALL M R, OTWELL W S. Phenoloxidases from pink and white shrimp: kinetic and other properties[J]. Journal of Food Biochemistry, 1988, 12(3): 205-218.

[22]ASPáN A, S?DERH?LL K. Purification of prophenoloxidase from crayfish blood cells, and its activation by an endogenous serine proteinase[J]. Insect Biochemistry, 1991, 21(4): 363-373.

[23] 劉芳. 蘋果膜結合態多酚氧化酶分離純化及性質研究[D]. 北京: 中國農業大學, 2015.

[24] 于冰. 產絮菌的差異表達蛋白質及其功能解析研究[D]. 哈爾濱: 哈爾濱工業大學, 2011.

[25] 李曉曼. 乳清蛋白的肽譜和蛋白質組研究[D]. 哈爾濱: 哈爾濱工業大學, 2018.

[26] IKAI A. Thermostability and aliphatic index of globular proteins[J]. The Journal of Biochemistry, 1980, 88(6): 1895-1898.

[27] KYTE J, DOOLITTLE R F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J]. Journal of Molecular Biology, 1982, 157(1): 105-132.

[28] ROST B, SANDER C. Combining evolutionary information and neural networks to predict protein secondary structure[J]. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 1994, 19(1): 55-72.

[29] 石鷗燕, 楊晶, 楊惠云,等. 簡單的一致性方法預測蛋白質二級結構[J]. 現代生物醫學進展, 2007, 7(11):1723-1724.

Purification and Identification of PPO fromand Its Bioinformatics Analysis

WEI Shuai, LIU Yuan, LIU Meng-na, SUN Qin-xiu, LIU Shu-cheng, JI Hong-wu, HAO Ji-ming, DENG Chu-jin, MAO Wei-jie

（1.,,,,,,524088,; 2.,116034,; 3.(Zhanjiang),524088,）

【Objective】To isolate and purify the PPO from, the biological information was identified and analyzed by using mass spectrometry.【Methods】PPO was isolated and purified from the shrimp cephalothorax by using ammonium sulfate precipitation and column chromatography. The molecular weight was determined by electrophoresis, and the amino acid sequence was determined by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI- MS/MS). Based on these results, homology modeling was constructed and the evaluations were performed.【Results and Conclusion】Purified PPO was obtained with a purification of 65.7 folds, the specific activity of PPO was 650.1 U/mg protein and with a yield of 29.5%. The molecular weight of PPO was about 72 ku. The similarity of amino acid sequence between the purified protein and Propolyphenoloxidase ofwas 65% with a matching score of 11 321 points by identification and analysis of mass spectrometry and basic local alignment search tool (blast) sequence comparison. The results have confirmed that the purified protein was PPO. PPO is an amphoteric protein and it has a higher hydrophilicity than hydrophobicity. The secondary structure of PPO mainly consists of α-helix and random coil. In conclusion, the predicted three-dimensional structure of PPO had a high reliability.

; PPO; mass spectrometry; identification; bioinformatics

Q78；Q959.223+.63

A

1673-9159（2020）04-0100-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.04.014

2020-05-17

廣東省區域聯合基金-青年基金項目（2019A1515110419)；國家重點研發計劃資助（2019YFD0902003）；國家自然科學基金面上項目（31771997）；南方海洋科學與工程廣東省實驗室（湛江）資助（ZJW-2019-06）；廣東海洋大學創新強校重大培育項目（GDOU2017052603）；國家蝦蟹產業技術體系（G-48）；廣東省普通高校青年創新人才項目（2019KQNCX040）；廣東普通高等學校海洋食品綠色加工技術研究團隊（2019KCXTD 011）

魏帥（1986—），男，博士，講師，研究方向為海洋食品加工新技術。E-mail：weishuaiws@126.com

孫欽秀（1986—），女，博士，講師，研究方向為海洋食品加工新技術。E-mail：sunqinxiugo@163.com；

劉書成（1977—），男，教授，研究方向為海洋食品加工新技術。E-mail：Lsc771017@163.com

魏帥，劉媛，劉蒙娜，等. 凡納濱對蝦多酚氧化酶的純化鑒定與生物信息學分析[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（4）：100-108.

（責任編輯：劉朏）