連翹中酚酸類成分的研究進展

劉暢 溫靜 閻新佳 李文蘭 李暢 江園園 鄭鑫 聶承冬

中圖分類號 R282 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）12-1516-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.12.20

摘 要 目的：為連翹的進一步開發利用提供參考。方法：以“連翹”“酚酸類化合物”“結構”“生物合成途徑”“提取分離”“藥理作用”“Forsythia suspensa”“Phenolic acids”“Structure”“Biosynthetic pathway”“Extraction and separation”“Pharmacological action”等為關鍵詞，在中國知網、萬方數據、維普網、PubMed等數據庫中組合查詢1995年9月-2020年2月發表的相關文獻，對連翹中酚酸類成分的結構類型、生物合成途徑、提取分離方法及藥理作用的研究進展進行歸納和總結。結果與結論：共檢索到相關文獻357篇，其中有效文獻68篇。連翹為我國傳統的常用中藥，其化學成分復雜。其中，酚酸為連翹中較為主要的一類化學成分，其化學結構一般包括以苯甲酸為母核的C6-C1型（如原兒茶酸、沒食子酸等）、以苯乙酸為母核的C6-C2型（如對羥基苯乙酸、對羥基苯基乙酸甲酯等）和以肉桂酸為母核的C6-C3型（如咖啡酸、綠原酸等），大多通過莽草酸和肉桂酸生物合成途徑生成。連翹酚酸類成分的提取溶劑一般選擇有機溶劑和水的混合體系，多采用色譜法進行分離。連翹酚酸類成分主要有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、保肝、抗菌、抗病毒等藥理作用。目前對連翹酚酸類成分及其活性的研究尚有較大空間，建議今后對其化學成分及藥理活性進行更深入的研究，優化其提取分離工藝，探究其藥效物質基礎，闡明其藥理作用機制，以推動該藥的進一步開發利用。

關鍵詞 連翹;酚酸類化合物;生物合成途徑;結構;提取分離;藥理作用

連翹為木犀科植物連翹[Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl]的干燥果實，是一味使用歷史悠久的中藥，素有“瘡家圣藥”之稱，其采收品分為青翹和老翹[1]，主產于我國河北、山西、陜西、河南、湖北等地[2]，具有清熱解毒、散結消腫之功效[3]。現代藥理研究表明，連翹具有抗腫瘤[4]、抗炎[5-6]、抗菌[6]、抗氧化[7]等作用。連翹化學成分較為復雜，主要有黃酮類、苯乙醇苷類、木脂素類、酚酸類、揮發油類等化學成分[8]。其中，酚酸類物質是連翹中重要的次生代謝產物之一，是一類具有多羥基酚結構的簡單苯丙素類成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等藥理活性[9]。目前，國內外學者對連翹中大部分化學成分已有多方面的研究，但對其酚酸類成分的研究有限。為此，筆者以“連翹”“酚酸類化合物”“結構”“生物合成途徑” “提取分離”“藥理作用”“Forsythia suspensa”“Phenolic acids”“Structure”“Biosynthetic pathway”“Extraction and separation”“Phacological action”等為中英文關鍵詞，在中國知網、萬方數據、維普網、PubMed等數據庫中組合查詢1995年9月-2020年2月發表的相關文獻。結果，共檢索到相關文獻357篇，其中有效文獻68篇。現對連翹中酚酸類化學成分的結構類型、生物合成途徑、提取分離方法及藥理作用的研究進展進行綜述，旨在為連翹的進一步開發利用提供參考。

1 連翹中酚酸類化學成分的結構類型

1.1 以苯甲酸為母核的C6-C1型

在連翹中，不少酚酸類成分屬于以苯甲酸為母核的C6-C1型酚酸[8，10]。目前研究顯示，在連翹中已分離鑒定出的以苯甲酸為母核的C6-C1型酚酸類化合物主要有丁香酸[11]、沒食子酸[12]、原兒茶醛[11，13]、香草酸[13]、對羥基苯甲酸[11，13]、原兒茶酸[14]、對羥基苯甲醇[13]、對羥基苯甲醛[13]、1-（4-羥基苯基）-2，3-二羥基丙酮[13]、單寧酸[15]等10種酚酸，其分子式和化學結構式詳見表1、圖1。

1.2 以苯乙酸為母核的C6-C2型

目前研究顯示，在連翹中已分離鑒定出的以苯乙酸為母核的C6-C2型酚酸類化合物包括對羥基苯乙酸[13]、對羥基苯基乙酸甲酯[16]、連翹醇酯[17]、4-（2-羥基乙基）苯甲醛[18]、對甲氧基苯乙醛[13]、Forsythiayarosiade C[19]、Forsythiayarosiade D[19]、對羥基苯乙醇[13]、3，4-二羥基苯乙醇[13]、4-hydroxyphenethyl 2-（4-hydroxyphenl）acetate[13]等10種酚酸，其分子式和化學結構式詳見表2、圖2。

1.3 以桂皮酸為母核的C6-C3型

以桂皮酸為母核的C6-C3型是連翹中酚酸類化學成分的另一類主要構型，主要為苯丙酸類，大多以簡單苯丙酸、苯丙酸苷類和苯丙酸聚合體的形式存在。目前研究顯示，在連翹中已分離鑒定出的苯丙酸類化合物包括咖啡酸[12]、反式香豆酸[11]、反式阿魏酸[11]、反式咖啡酸甲酯[14]、綠原酸[20]等5種酚酸，其分子式詳見表3，化學結構式詳見圖3、表4。

2 連翹中酚酸類成分的生物合成途徑

酚酸類成分大多通過莽草酸和肉桂酸生物合成途徑生成[21]（因連翹中酚酸類成分報道較少，且研究多為C6-C1型和C6-C3型，故未對C6-C2型進行表述）。

2.1 苯甲酸生物合成途徑

苯甲酸類化合物的合成途徑主要包括苯丙氨酸次級代謝和莽草酸轉化[22]。其中，莽草酸轉化途徑始于磷酸烯醇式丙酮鹽（PEP）和4-磷酸-D-赤蘚糖的偶聯反應，然后通過醛縮合反應生成3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸酯（DAHP），再經過生物體內一系列復雜的酶催化反應得到莽草酸，再經過一系列化學反應衍生得到一些簡單的C6-C1型酚酸類成分[10，23]，詳見圖4。

2.2 桂皮酸生物合成途徑

連翹中以桂皮酸為母核的C6-C3結構的化合物的生物合成途徑主要始于苯丙氨酸或酪氨酸，首先由葡萄糖代謝為莽草酸，再經過莽草酸途徑得到苯丙氨酸和酪氨酸。在植物體內經側鏈脫氫后得到香豆酸。如果是苯丙氨酸，將先生成桂皮酸，再被氫化成香豆酸;而酪氨酸會直接生成香豆酸，然后再通過一系列羥基化和甲基化生成桂皮酸的衍生物，詳見圖5[23-24]。

3 連翹中酚酸類成分的提取、分離

3.1 連翹中酚酸類成分的提取

酚酸類化合物多含有酚羥基，且酚羥基是其主要活性基團。但該基因容易受到光照、溫度等外界因素的影響，大多易被氧化成羰基而失去活性。因此，連翹中酚酸類成分的提取應選擇新鮮的原材料，在適當的條件下進行提取分離，避免在日光或酶的作用下變性變質，同時還應避免長時間高溫高熱。由于酚酸類化合物在植物體內通常會與蛋白質和多糖形成穩定的復合物，所以酚酸類化合物的提取溶劑應對其具有很強的溶解性，因此有機溶劑和水的混合體系最適宜于酚酸類成分的提取[10]。但應注意的是，選擇的提取溶劑不可與連翹中酚酸類成分以及連翹中其他類化學成分發生反應。例如，王福男[12]將連翹加水溫浸30 min后，煎煮2次，每次1 h，合并兩次煎煮后的濾液，濃縮，放冷至40 ℃，緩慢加入乙醇至含醇量達75%，充分攪拌，靜置12 h，濾過，取上清液，回收乙醇至無醇味，加入3～4倍量（mL/g）水，靜置12 h，濾過，取上清液，加熱濃縮，放冷至40 ℃，加入乙醇至醇量達85%，靜置12 h，濾過，取上清液，回收乙醇至無醇味，得總浸膏。田粟等[25]采用正交設計法確定了超聲提取連翹葉總酚酸的最佳超聲提取條件為以20倍量（mL/g）60%甲醇作為提取溶劑，在45 ℃下超聲提取3次，每次10 min。閻新佳等[13]則采用回流提取法提取連翹干燥果實中的酚酸類成分，以50%乙醇作為提取溶劑，提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮得總浸膏，經進一步萃取及多種分離色譜技術分離純化后得到酚酸類化合物單體。趙志勇等[18]同樣采用回流提取法，提取連翹干燥果實中的酚酸類成分，提取溶劑則為60%乙醇，提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮得總浸膏，經進一步萃取及色譜分離后得到酚酸類化合物單體。目前，有關酚酸的提取報道總體較少，有待今后進一步研究。

3.2 連翹中酚酸類成分的分離

連翹中小分子的酚酸類化合物主要集中在氯仿和乙酸乙酯萃取部位中，其糖苷則多見于正丁醇萃取部位。連翹中酚酸類成分多采用色譜法分離，色譜柱的固定相或吸附劑通常是C18、陰離子交換樹脂和分子印跡聚合物（MIP）[26]。王福男[12]采用X-5型大孔吸附樹脂以不同體積分數乙醇對連翹提取物進行梯度洗脫，其中40%乙醇洗脫部分依次通過硅膠柱色譜、Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜以及反相高效液相色譜法（HPLC）制備型柱色譜分離得到酚酸類化合物單體。閻新佳等[13]將連翹乙醇提取物浸膏加水稀釋后，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取。其中，乙酸乙酯萃取部位用適量水溶解后，采用大孔吸附樹脂柱色譜進行分離，分別用10%、30%、50%、95%乙醇進行梯度洗脫;取50%乙醇洗脫部分用硅膠柱色譜進行分離，用不同體積比的二氯甲烷-甲醇混合溶液進行梯度洗脫后，依次經過Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜、硅膠柱色譜、聚酰胺柱色譜并結合半制備型液相分離系統純化得到酚酸類化合物單體。趙志勇等[17]采用同樣的方法，分別用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇對連翹乙醇提取物進行萃取，取乙酸乙酯萃取部位通過大孔吸附樹脂以10%、30%、60%、95%乙醇梯度洗脫后，采用Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜、ODS柱色譜等對上述60%乙醇洗脫部分進行分離純化，得到酚酸類化合物單體，最后再根據單體的理化性質和波譜數據鑒定其結構。

4 藥理作用

4.1 抗氧化、抗自由基作用

酚酸類成分是連翹中廣泛存在的具有抗氧化活性的次生代謝產物[27]。有研究表明，酚酸類成分有較強的抗氧化、抗自由基作用，并且其抗氧化活性與其羥基個數及取代基位置相關，即隨著羥基個數的增加，其抗氧化能力逐漸增強;在取代基相同時，C6-C3型酚酸類成分的抗氧化能力強于C6-C1型酚酸類分成，例如咖啡酸的抗氧化能力強于原兒茶酸[28]。酚酸的抗氧化能力還與總酚酸的含量成正相關。例如，王燕等[29]研究發現，隨著連翹中總酚酸含量的增加，其清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的能力逐漸加強。酚酸的濃度對其抗氧化活性也有影響，范金波等[30]采用鉬酸銨法比較了不同濃度（0.02～0.1 mg/mL）咖啡酸的抗氧化能力，結果顯示，咖啡酸的抗氧化能力隨其濃度的增加而有所增強。張飛[31]通過HPLC-DPPH離線法識別連翹葉中能夠消除DPPH自由基的成分，發現連翹中的酚酸類成分綠原酸對DPPH自由基具有清除作用。Jiao J等[32]從連翹制成的茶浸液中分離得到綠原酸，并采用DPPH法評價其抗氧化能力，發現其半數抑制濃度（IC50）[（0.083±0.002） mg/mL]與陽性對照藥物抗壞血酸（VC）[（0.062±0.002） mg/mL]相似，表明該化合物具有與VC相當的抗氧化活性。

4.2 抗腫瘤作用

連翹中的酚酸類成分在體內外研究中均表現出一定的抗腫瘤活性，如沒食子酸、綠原酸、咖啡酸等[33-35]。郗艷麗[36]采用MTT法、環境掃描電鏡技術和激光共聚焦顯微技術檢測到沒食子酸可抑制3種人肺癌細胞（95-D細胞、A549細胞和NCI-H460細胞）的增殖并誘導其凋亡。Kawada K等[37]將LL-2肺癌細胞移植到C57Black小鼠體內，并以沒食子酸進行干預，利用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP生物素缺口末端標記法（TUNEL）測得模型組和給藥組小鼠腫瘤組織中的TUNEL陽性細胞數分別為（2.8±1.7）、（7.4±4.1）個，即給藥組小鼠的凋亡細胞明顯更多。該研究表明，沒食子酸可通過誘導腫瘤細胞的凋亡來抑制移植性肺癌細胞的生長。

另有研究表明，綠原酸可預防結腸癌、口腔癌等疾病的發生，并且其可促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞生長[38]。Yamagata K等[39]采用MTT法檢測了綠原酸對人肺癌A549細胞增殖的影響，并借助聚合酶鏈式反應法（PCR）分析其可能機制。結果顯示，經綠原酸處理后的肺癌細胞存活率降低，Bcl-2基因的表達下降，Bax基因的表達增加，提示綠原酸可通過影響肺癌細胞相關凋亡基因的表達來促進肺癌細胞的凋亡。Yan Y等[40]研究發現，綠原酸可以通過抑制人肝癌HepG2細胞增殖、誘導胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2）失活、抑制HepG2異種移植組織中基質金屬蛋白酶2（MMP-2）和MMP-9表達等多種途徑來阻止肝癌的進一步發展。Li HR等[41]研究發現，30、60 μmol/L的綠原酸均能顯著抑制B16小鼠黑色素瘤細胞增殖。

研究表明，連翹中存在的酚酸類成分咖啡酸也具有抗腫瘤活性。Dziedzic A等[42]利用流式細胞術分析了咖啡酸對人頭頸部鱗癌Detroit 562細胞增殖和凋亡的影響，結果表明，50 μmol/L的咖啡酸即可誘導Detroit 562細胞凋亡。Brautigan DL等[43]在土撥鼠WHC-17肝癌細胞培養基中加入咖啡酸，12 h后活細胞數明顯減少，表明咖啡酸可通過誘導肝癌細胞凋亡來抑制肝癌細胞的增殖。

4.3 抗炎作用

相關研究發現，連翹可改善由結腸炎所引起的結腸組織病理學損害，包括上皮細胞壞死、炎性細胞浸潤、潰瘍和黏膜下水腫等[44-52]。連翹可抑制結腸炎模型小鼠的腸道炎癥，研究者推測連翹對結腸炎的藥理作用可能源于其酚酸類成分（咖啡酸、綠原酸和原兒茶酸）[44]。阿魏酸是連翹酚酸類成分中的一種[45]，吳建良等[46]研究發現，阿魏酸可通過ERK信號通路抑制炎癥因子表達，并且該化合物具有抑制小膠質細胞活化和神經性炎癥的作用。Su JH等[47]研究發現，綠原酸不僅能顯著抑制脂多糖（LPS）誘導的小鼠RAW 264.7細胞和BV2小神經膠質細胞中一氧化氮（NO）的產生，而且還能顯著抑制誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、環氧合酶2（COX-2）的表達，減少促炎細胞因子[包括白細胞介素1（IL-1）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）]和其他炎癥相關標志物（如IL-6）的產生，且呈劑量依賴性，提示該化合物可用于預防和治療炎癥反應性疾病。Lee JH等[48]研究發現，綠原酸對由白色念珠菌引起的敗血癥性關節炎模型BALB/c小鼠具有保護作用，這種作用可能是通過抑制巨噬細胞產生NO和抑制T細胞增殖來介導的。Chen DY等[49]研究發現，綠原酸可抑制脊髓損傷模型大鼠的炎癥反應，降低iNOS活性，抑制COX-2蛋白表達，并可通過Toll樣受體4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）和p38信號通路介導的抗炎作用來減輕脊髓損傷。由COX-2產生的前列腺素E2（PEG2）是一種重要的促炎介質，其可誘導機體產生紅、熱、腫、痛等一系列炎癥反應[50]。Shan JH等[51]研究發現，綠原酸可通過抑制NF-κB和c-Jun氨基末端激酶/活化蛋白1（JNK/AP-1）信號通路的激活，顯著降低LPS誘導的RAW264.7細胞中COX-2的表達，從而抑制該細胞釋放PEG2，最終達到抗炎的目的。Guo YJ等[52]研究了綠原酸對單純皰疹病毒1（HSV-1）誘導的BV2小膠質細胞的抗炎作用，其采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）和實時熒光定量PCR法檢測TNF-α、IL-6及其mRNA的表達水平，結果表明，綠原酸可通過抑制TLR2/TLR9/髓樣分化因子88（MyD88）信號通路來抑制HSV-1誘導的TNF-α和IL-6釋放，并且對其mRNA的表達也有明顯的抑制作用。

4.4 保肝作用

有研究發現，連翹對肝臟具有一定的保護作用[53]，這與其酚酸類成分對肝損傷的保護有關[54]。Zhang Y等[55]研究發現，棕櫚酸可誘導內質網應激，致使肝細胞凋亡;但綠原酸可抑制這種凋亡，減輕棕櫚酸對肝細胞的損傷。血清丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）和乳酸脫氫酶（LDH）活性的顯著升高是酒精攝入后肝臟急性損傷的重要指標之一，Kartkaya K等[56]研究發現，沒食子酸可顯著減弱上述酶類的活性，提示該化合物可能具有肝臟保護作用。Kim H等[57]研究發現，與單純灌胃乙醇的小鼠相比，灌胃乙醇并且分別注射不同劑量（10、20、40 mg/kg）綠原酸的小鼠血清中ALT和AST活性呈劑量依賴性衰減，推測綠原酸可通過抑制氧化應激而有效減輕酒精性肝病，對肝損傷起到保護作用。Ali N等[58]研究了綠原酸對甲氨蝶呤（MTX）誘導的肝損傷模型大鼠的保護作用，結果發現MTX組大鼠血清ALT、AST和LDH含量均顯著高于正常對照組，而綠原酸處理組大鼠上述指標的含量均顯著低于模型組（P<0.05），同時綠原酸還可抑制COX-2、iNOS、Bcl-2和胱天蛋白酶（Caspase-3）、Caspase-9介導的炎癥和細胞凋亡，改善MTX誘導的組織學改變，該研究表明綠原酸可通過減少促炎介質和凋亡介質而發揮對MTX所致肝損傷的保護作用。相關研究表明，綠原酸還可預防對乙酰氨基酚引起的肝損傷[59]。

4.5 抗菌作用

連翹抗菌活性與其酚酸含量成正相關，酚酸含量越高，其抗菌作用越強[60]。 Kepa M等[61]研究發現，咖啡酸可抑制金黃色葡萄球菌，且最低抑菌濃度（MIC）為512 μg/mL。另外相關研究報道，綠原酸對肺炎鏈球菌、志賀氏痢疾桿菌和嗜麥芽窄食單胞菌均具有良好的抑制活性[62-63]。Kabir F等[64]采用紫外分光光度法以及記錄MacConkey瓊脂平板中的活細胞數量來評價綠原酸的殺菌（大腸桿菌）效果，結果表明，綠原酸及相關化合物（阿魏酸、苯甲酸和羥基苯甲酸）均具有抑菌和殺菌作用。許維國等[65]研究表明，連翹中存在的沒食子酸具有一定的抑菌效果，尤其對金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門菌的抑制效果較好。

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（收稿日期：2020-03-23 修回日期：2020-05-14）

（編輯：孫 冰）