升陽(yáng)益胃湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠HIF-1、TAK-1表達(dá)的影響*

楊 闊，韓 毅，劉華一△，路理杰，王秀娟

1.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院(天津 300120)；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)(天津 300193)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)多見于20～40歲[1]，據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，我國(guó)目前UC發(fā)病率為11.6/10萬(wàn)[2-3]，而且有證據(jù)表明成逐年上升趨勢(shì)[4]。臨床以腹痛、腹瀉、黏液膿血便和里急后重為主要癥狀，該病遷延難愈，極易復(fù)發(fā)，且有癌變傾向，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，已被WHO列為現(xiàn)代難治病之一[5-7]。中醫(yī)藥治療潰瘍性結(jié)腸炎療效顯著，復(fù)發(fā)率低，并且有長(zhǎng)期療效好及副作用少等優(yōu)勢(shì)。HIF-1、TAK-1通路是重要的炎癥信號(hào)，本實(shí)驗(yàn)采用升陽(yáng)益胃湯干預(yù)UC大鼠模型，并觀察HIF-1、TAK-1表達(dá)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠36只，體重(200±20)g，雌雄各半，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)有限公司。

2 主要試劑 升陽(yáng)益胃湯(黃芪、人參、半夏、白術(shù)、茯苓、橘皮、甘草、防風(fēng)、羌活、獨(dú)活、柴胡、澤瀉、白芍、黃連)由我院制劑室提供，煎煮前加10倍量蒸餾水浸泡30 min，按常規(guī)煎藥法煎煮2次，每次30 min，過(guò)濾藥液并濃縮至每1 ml藥液含生藥2 g，經(jīng)高壓滅菌冷卻，放置于4 ℃冰箱備用，使用時(shí)稀釋至所需濃度。柳氮磺吡啶腸溶片(SASP)(上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司)，5%葡聚糖硫酸鈉溶液(天津市鐸輝生物醫(yī)藥有限公司)。蘇木素-伊紅染色試劑盒購(gòu)自天津百浩生物科技有限公司，HIF-1、TAK-1抗體及試劑盒購(gòu)自天津市鐸輝生物醫(yī)藥有限公司。

3 潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型建立 動(dòng)物隨機(jī)分為兩組，即正常對(duì)照組6只和模型組30只。造模成功后，模型組再分為：模型對(duì)照組6只；升陽(yáng)益胃湯高劑量組6只、中劑量組6只、低劑量組6只；西藥組6只。

造模方法：首先把大鼠在SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，然后正常對(duì)照組給予消毒蒸餾水自由飲用10 d。模型組采用5%葡聚糖硫酸鈉溶液灌胃，常規(guī)飲食不變，連續(xù)21 d。

4 動(dòng)物分組與給藥 中藥用升陽(yáng)益胃湯煎劑，大鼠用藥量根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效計(jì)量以及高、中、低劑量計(jì)算法確定。升陽(yáng)益胃湯高劑量組(22 g/kg)、升陽(yáng)益胃湯中劑量組(11 g/kg)、升陽(yáng)益胃湯低劑量組(5.5 g/kg)、西藥組(0.2 g/kg)，采取灌胃途徑按各組藥物劑量給藥，連續(xù)28 d；模型對(duì)照組和正常對(duì)照組給予等容的蒸餾水灌胃，連續(xù)28 d。

實(shí)驗(yàn)步驟：各組大鼠先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。1周后除正常組外其余各組大鼠均開始造模。第4周開始，中藥組及西藥組按各自劑量采取灌胃途徑給藥；模型對(duì)照組和正常對(duì)照組給予等容的蒸餾水灌胃。連續(xù)28 d后，將大鼠麻醉取材，檢測(cè)指標(biāo)。

5 標(biāo)本采集與處理 末次灌胃結(jié)束后各組大鼠禁食不禁水24 h，然后麻醉，固定，剖取整個(gè)結(jié)腸組織，并沿縱軸剪開，清洗干凈。截取病變結(jié)腸組織中的一部分，放置于4%多聚甲醛溶液中固定，然后制成病理切片；剩余的病變結(jié)腸組織置于做好標(biāo)記的離心管中，于-80℃保存，用于Elisa檢測(cè)。

6 疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI) 大鼠體重下降：<1% 為0分，1% ～5%為1分，5%～10%為2分，10%～15% 為3分，> 15% 為4分；大便黏稠度：正常為0分，松散的大便為2分，腹瀉為4分；大便出血：正常0分，隱血陽(yáng)性為2分，顯性出血為4分；綜合以上三種情況進(jìn)行綜合評(píng)分，其總分除以3即為DAI。

7 結(jié)腸組織HE染色 取大鼠結(jié)腸組織，OCT包埋，液氮中保存，機(jī)器切片，浸蠟，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、封片、鏡檢，HE染色后顯微鏡下觀察。

8 電鏡檢查 電鏡下觀察各組大鼠結(jié)腸組織的超微結(jié)構(gòu)，檢查其損傷及恢復(fù)情況。

9 結(jié)腸HIF-1、TAK-1表達(dá)水平 采用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法(ELISA)檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織HIF-1、TAK-1表達(dá)水平的影響。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，組間差異采用單因素方差分析比較。本文所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 升陽(yáng)益胃湯對(duì)UC大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)的影響 與正常組比較，模型組大鼠DAI顯著升高(P<0.05)；干預(yù)組中，西藥組可以降低大鼠DAI(P<0.05)，升陽(yáng)益胃湯組顯示與西藥組相同的作用，且存在一定的量效關(guān)系。見表1。

表1 升陽(yáng)益胃湯對(duì)UC大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)的影響

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2 升陽(yáng)益胃湯對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織病理變化的影響

2.1 HE染色：正常組黏膜層上皮結(jié)構(gòu)完整，黏膜固有層無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下層無(wú)充血、水腫，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組：多數(shù)黏膜層和肌層變薄，炎癥現(xiàn)象明顯，腺體萎縮，可見淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞。與模型組比較，西藥組、升陽(yáng)益胃湯組上述病理改變均減輕，且升陽(yáng)益胃湯高劑量組效果更為顯著(圖1)。

2.2 電鏡：正常組腸黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，緊密。腸腔微絨毛完整，排列整齊，大小一致。上皮細(xì)胞間縫隙鏈接豐富，胞漿內(nèi)細(xì)胞器豐富。模型組：腸黏膜上皮細(xì)胞排列疏松，腸腔游離緣不整齊，大部分微絨毛脫落，殘存的微絨毛零星分布，且大小不一，排列紊亂。胞漿內(nèi)部分線粒體出現(xiàn)腫脹，嵴消失，呈空泡狀。升陽(yáng)益胃湯低劑量組：同模型組。升陽(yáng)益胃湯中劑量組：細(xì)胞排列較為整齊，腸絨毛部分恢復(fù)，數(shù)量較多，但仍存在大小不一，排列整齊欠佳，線粒體基本完好，個(gè)別出現(xiàn)腫脹，嵴斷裂。升陽(yáng)益胃湯高劑量組：比中劑量組較好同正常組。西藥組：同正常組(圖2)。

圖1 升陽(yáng)益胃湯對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織病理變化的影響(HE染色，×100)

圖2 升陽(yáng)益胃湯對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織電鏡變化的影響(80kV，×26500)

3 升陽(yáng)益胃湯對(duì)UC大鼠結(jié)腸HIF-1、TAK-1表達(dá)的影響 HIF-1：模型組和西藥組與正常對(duì)照組比較顯著升高(P<0.05)；西藥組和升陽(yáng)益胃湯組高、中、低劑量組均模型組顯著降低(P<0.05)；升陽(yáng)益胃湯高、中、低劑量組均較西藥組顯著降低(P<0.05)。

TAK-1：模型組、西藥組、升陽(yáng)益胃湯低、高劑量組均較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05)；升陽(yáng)益胃湯低、中劑量組較模型組顯著降低(P<0.05)；升陽(yáng)益胃湯中劑量組較西藥組、升陽(yáng)益胃湯低、高劑量組TAK-1均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 UC大鼠結(jié)腸HIF-1、TAK-1表達(dá)(pg/ml)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與西藥組比較，△P<0.05

討 論

潰瘍性結(jié)腸炎屬中醫(yī)學(xué)“泄瀉”“腸風(fēng)”“腸澼”“下利”“久痢”“休息痢”“滯下”等范疇，現(xiàn)代醫(yī)家多認(rèn)為本病為本虛標(biāo)實(shí)之證。本虛多為脾虛、腎虛；標(biāo)實(shí)則為濕、毒、瘀、熱。臨床上治療原則為扶正祛邪，分別采用健脾補(bǔ)腎，清熱祛濕，解毒化瘀等方法予以治療[8-12]。 “陰火”理論為李東垣創(chuàng)立，“陰火”一詞首見于《內(nèi)外傷辨惑論》，又在《脾胃論》中闡發(fā)。陰火理論則是內(nèi)傷脾胃學(xué)說(shuō)的核心內(nèi)容，脾胃內(nèi)傷，清陽(yáng)下陷，氣虛發(fā)熱，是陰火產(chǎn)生的根本原因；以補(bǔ)益脾胃，升清脾陽(yáng)，清降陰火為治療原則。潰瘍性結(jié)腸炎雖病位在大腸，但與脾臟關(guān)系密切。從“陰火”理論論治本病，實(shí)質(zhì)是從脾胃入手，調(diào)暢氣機(jī)升降，兼以清熱化濕，切合潰瘍性結(jié)腸炎病機(jī)及治療原則。升陽(yáng)益胃湯為“陰火”理論的代表方劑，出自《內(nèi)外傷辨惑論》,黃芪為君，人參、半夏、白術(shù)、茯苓、橘皮、甘草為臣，防風(fēng)、羌活、獨(dú)活、柴胡、澤瀉為使，白芍、黃連為佐。組方升降、寒溫并用，除濕與和營(yíng)并用，復(fù)合脾胃之水谷納運(yùn)相得、氣機(jī)升降相因、陰陽(yáng)燥濕相濟(jì)之生理機(jī)能。諸藥合用補(bǔ)中有散，發(fā)中有收，使氣足陽(yáng)升，正旺而邪祛，共奏益氣升陽(yáng)、升清降濁、清熱除濕、解毒之功效。

低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)與TAK-1均與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。在動(dòng)脈硬化、關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病患者的炎癥部位都發(fā)現(xiàn)了低氧環(huán)境和HIF的激活，在中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和一些非免疫細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，HIF可以激活NF-κB等炎癥因子[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，活化的TAK-1可激活NF-κB和JNK/SAPK兩條炎癥通路，導(dǎo)致一系列相關(guān)基因的表達(dá)，產(chǎn)生致炎因子，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等，從而導(dǎo)致腸道黏膜的炎癥反應(yīng)[15]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，HIF-1與TAK-1 UC的發(fā)病密切相關(guān)。治療后，HIF-1與TAK-1均明顯降低，說(shuō)明兩指標(biāo)與炎癥的程度成正相關(guān)性。

綜上，本實(shí)驗(yàn)研究顯示升陽(yáng)益胃湯可降低潰瘍性結(jié)腸炎大鼠HIF-1和TAK-1的表達(dá)，抑制炎癥的反應(yīng)，從而對(duì)本病起到治療作用，且有一定的量效關(guān)系。