電針結(jié)合傳統(tǒng)針刺百會(huì)、大椎穴對(duì)腦缺血模型大鼠GAP-43表達(dá)的影響*

惠建榮，羊 璞，趙 嫻 ，龐苗苗，惠建安，王院春

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院(咸陽(yáng)712046)；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(咸陽(yáng)712000)；3.武警陜西省總隊(duì)醫(yī)院(西安710054)；4.陜西省富平縣第二人民醫(yī)院(富平714000)

缺血性腦血管病(Ischemic cerebral vascular disease,ICVD)是腦內(nèi)血管阻塞引起的局部腦血流量減少，缺血中心區(qū)域細(xì)胞處于缺血缺氧狀態(tài)，從而導(dǎo)致細(xì)胞大量凋亡，神經(jīng)組織缺損的一種疾病，包含兩種類型為缺血性腦卒中和短暫性腦缺血發(fā)作，其中最常見(jiàn)的為腦卒中，約占所有缺血性腦血管病的86%，具有高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率和高死亡率的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類的健康和生活質(zhì)量。據(jù)報(bào)道，腦血管病(又稱卒中)是近年導(dǎo)致我國(guó)公民死亡的主要原因之一[1]。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)每年有150萬(wàn)～200萬(wàn)新發(fā)腦血管病的病例，現(xiàn)有腦血管病患者700余萬(wàn)人，其中約70%為缺血性腦血管病[2]。針灸治療缺血性腦卒中已經(jīng)得到證實(shí)與推廣[3]。本研究選用百會(huì)、大椎，從分子水平研究針刺促腦缺血后神經(jīng)再生的作用機(jī)制，探討針刺對(duì)腦缺血大鼠腦內(nèi)神經(jīng)再生相關(guān)信號(hào)GAP-43蛋白的影響，為深入研究腦缺血后神經(jīng)再生的治療方法奠定基礎(chǔ)。

材料及方法

1 材料選取及針刺取穴方法 選取健康成年SPF級(jí)雄性SD大鼠150只，體重230～270 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心提供。針刺取穴：百會(huì)(DU20)、大椎(DU14)，定位參考照大鼠的常用針灸穴位：“百會(huì)”位于頂骨正中,“大椎”在第7頸椎與第1胸椎間，背部正中。以1寸毫針(0.3 mm×25 mm)向后平刺百會(huì)0.5寸，直刺大椎0.3寸。

2 模型制備 采用栓線法制作大鼠大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，將大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉(劑量為0.35 ml/100 g)后仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上。切開(kāi)大鼠頸部正中皮膚及淺筋膜，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌，分別分離左側(cè)頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，將魚(yú)線線栓頭用硅膠包裹，用制備好的魚(yú)線沿頸外動(dòng)脈插至頸內(nèi)動(dòng)脈。動(dòng)物清醒后采用Bederson法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，評(píng)分1～3分者為模型成功[4]。

3 分組及干預(yù)方法

3.1 模型分組：模型制備成功后按隨機(jī)區(qū)組化法分為四組:模型組、電針組、傳統(tǒng)針刺組、電針結(jié)合傳統(tǒng)針刺組，每組各30只。各組又隨機(jī)平均分為術(shù)后3 d、7 d、21 d 3個(gè)不同時(shí)段亞組，同時(shí)設(shè)立假手術(shù)組30只。

3.2 干預(yù)方法：模型組術(shù)后不予處理；電針組予針刺入穴位后電針干預(yù)，接G6805-2型電針儀，采用連續(xù)波，頻率120次/min，電流強(qiáng)度1 mA,輸出電壓2～4 V，以大鼠耐受且局部組織輕微顫抖為度，每天干預(yù)1次，每次干預(yù)時(shí)間為30 min[5]；針刺組予針刺干預(yù)，每次針刺入穴位后，每隔5 min捻轉(zhuǎn)行針1次，頭針頻率200次/min，體針80次/min，每天干預(yù)1次，每次留針30 min；電針結(jié)合傳統(tǒng)針刺組，行電針及傳統(tǒng)針刺方法，每日1次。假手術(shù)組30只作實(shí)驗(yàn)大鼠大腦中動(dòng)脈的充分暴露，不予栓線。

4 觀察指標(biāo)

4.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分：各組大鼠在造模后3 d、7 d、21 d 3個(gè)不同時(shí)段采用修正神經(jīng)功能缺損評(píng)分(Neurological severity scores,NSS)對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)估。神經(jīng)功能依據(jù)其受損程度分為0～18分，0分即為正常，18分即為最嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺失。NSS根據(jù)一系列的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射及平衡試驗(yàn)等進(jìn)行評(píng)分。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不能完成規(guī)定的動(dòng)作或者反射即給1分，因此評(píng)分越高，其神經(jīng)功能損害越嚴(yán)重[5]。

4.2 腦組織的病理改變及免疫組化檢測(cè)：各組大鼠分別于3 d、7 d、21 d 3個(gè)不同時(shí)段，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取10只。用6%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)，剪開(kāi)胸腔，仔細(xì)剪開(kāi)心包膜，暴露心臟，在心尖處剪一小切口，用9#針頭插入左心室，灌注0.9%生理鹽水，剪開(kāi)右心耳讓血液流出，至右心耳流出液為無(wú)色透明時(shí)開(kāi)始用4%多聚甲醛灌注固定。固定后立即剖顱取腦，在視交叉處切開(kāi),冠狀切取 2 mm 厚包含梗死灶區(qū)域及左右半球的組織塊浸于4%多聚甲醛中再固定。在梗死區(qū)取約0.5 mm厚腦組織50%、75%、85%、95%、100%乙醇梯度脫水；二甲苯透明；浸蠟包埋；連續(xù)冠狀切片，切片厚5 μm。切片備用并進(jìn)行HE染色及免疫組化染色檢查。最后 Olympus BX51顯微鏡觀察并攝片，采用JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析[6]。

結(jié) 果

1 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。假手術(shù)組大鼠各時(shí)間段神經(jīng)功能未見(jiàn)明顯異常，評(píng)分為0分，各時(shí)間段模型組神經(jīng)功能評(píng)分與假手術(shù)組比較顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在各時(shí)間段其他組與模型組比較，電針組、傳統(tǒng)針刺組、電針結(jié)合傳統(tǒng)針刺組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均較模型組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后第7天和第21天，與電針組、傳統(tǒng)針刺組比較，電針結(jié)合傳統(tǒng)針刺組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2 各組不同時(shí)點(diǎn)腦組織GAP-43蛋白的免疫組化表達(dá)情況 免疫組化檢測(cè)缺血周邊區(qū)GAP-43的表達(dá)情況見(jiàn)表2。各時(shí)間段模型組腦組織GAP-43蛋白的免疫組化表達(dá)與假手術(shù)組比較顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在各時(shí)間段其他組與模型組比較，電針組、傳統(tǒng)針刺組、電針結(jié)合傳統(tǒng)針刺組大鼠相應(yīng)區(qū)域GAP-43免疫活性較模型組GAP-43免疫活性增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后第3天、第7天和第21天，與電針組、傳統(tǒng)針刺組比較，電針結(jié)合傳統(tǒng)針刺大鼠GAP-43免疫活性顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較(分)

注：與模型組比較，△P<0.05；與電針組比較，▲P <0.05；與傳統(tǒng)針刺組比較，#P<0.05；與假手術(shù)組比較，*P<0.05

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)腦組織GAP-43蛋白免疫組化表達(dá)情況比較(nmol/ml)

注：與模型組比較，△P<0.05；與電針組比較，▲P<0.05；與傳統(tǒng)針刺組比較，#P<0.05；與假手術(shù)組比較，*P<0.05

討 論

缺血性腦血管病屬于中醫(yī)“中風(fēng)”范疇[7]，基本病機(jī)為氣血逆亂、腦脈痹阻或血溢于腦所致，其病位主要在腦。《難經(jīng)·二十八難》云：“督脈者，起于下極之輸，并于脊里，上至風(fēng)府，入屬于腦。”并且督脈為陽(yáng)脈之海，總督一身之陽(yáng)，其循行入屬于腦，因此，督脈與腦的關(guān)系非常密切。“經(jīng)脈所過(guò)、主治所及”，經(jīng)穴具有治療其經(jīng)脈所過(guò)部位臟腑、組織及聯(lián)系器官的疾病。所以督脈擅長(zhǎng)治療神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病；選用督脈腧穴百會(huì)、大椎治療中風(fēng)，具有通利樞機(jī)、開(kāi)竅醒神、滋陰抑陽(yáng)、活血化瘀、益腎補(bǔ)髓等作用，使功能得復(fù)。

GAP-43為神經(jīng)組織特異性磷酸蛋白，表達(dá)在發(fā)育或再生軸突的生長(zhǎng)錐末端，可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、軸突再生和突觸重構(gòu)，是軸突生長(zhǎng)分子標(biāo)志蛋白，中樞神經(jīng)損傷后，GAP-43在腦組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、突觸形成和可塑性以及神經(jīng)再生有著密切的關(guān)系[8-10]。ICVD會(huì)嚴(yán)重?fù)p害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，眾多學(xué)者認(rèn)為GAP-43是研究腦損傷修復(fù)的首選標(biāo)志物之一[6,11-12]，針刺對(duì)促進(jìn)ICVD后神經(jīng)修復(fù)具有較好的治療作用，筆者前期采用針刺治療ICVD患者取得了較好的臨床療效[13]，但機(jī)制還不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)，電針組、傳統(tǒng)針刺組、電針結(jié)合傳統(tǒng)針刺組均可促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，以及促進(jìn)腦損傷周圍存活的神經(jīng)元軸突末梢的GAP-43蛋白表達(dá)，且電針結(jié)合傳統(tǒng)針刺組較電針組及傳統(tǒng)針刺組的效果更佳，其作用可能是與針刺刺激能夠調(diào)節(jié)缺血區(qū)腦細(xì)胞內(nèi)離子通道和離子含量有關(guān)[14-15]。因此，基于“督脈入屬于腦”理論針刺百會(huì)、大椎穴對(duì)腦缺血大鼠腦內(nèi)神經(jīng)再生相關(guān)信號(hào)GAP-43蛋白的表達(dá)具有提高的作用。

綜上所述，電針結(jié)合傳統(tǒng)針刺百會(huì)、大椎可以促進(jìn)GAP-43陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)，進(jìn)而改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能，促進(jìn)缺血區(qū)的神經(jīng)修復(fù)，可能與針刺調(diào)控細(xì)胞內(nèi)離子通道和離子含量相關(guān)，促進(jìn)腦神經(jīng)的重塑。由此，基于“督脈入屬于腦”理論針刺百會(huì)、大椎穴可有效地提高ICVD大鼠神經(jīng)再生相關(guān)信號(hào)GAP-43蛋白的表達(dá)水平，在防治ICVD上具有一定作用。