靶向結合骨肉瘤血管內皮細胞短肽的體外功能驗證

楊瀾波 鄒春雨 米豫飛 王戰朝 史占軍 黃 濤

骨肉瘤起源于成骨細胞，是最常見的運動系統惡性腫瘤，多見于膝關節周圍，占青少年骨腫瘤的56%，其特點是全身轉移快及局部侵襲強[1～3]。雖然越來越多的新方法被用于骨肉瘤的診斷和治療，但自20世紀90年代以來，骨肉瘤的總體生存率并沒有提高[4]。通過大劑量化療來克服腫瘤耐藥的同時常伴隨著嚴重的不良事件，如嚴重的骨髓抑制和其他器官毒性，甚至可能危及生命[5]。如何實現有效治療腫瘤的同時盡可能降低化療藥物的不良反應，是當前研究的一個熱點。隨著腫瘤分子生物學的發展，人們逐漸開始關注骨肉瘤的靶向化療[6]。

血管可以為腫瘤細胞輸送營養物質和氧氣，若無足夠的新生血管，腫瘤就無法生長[7]。因此，腫瘤內的血管系統可作為治療腫瘤的一個有效靶點[8]。腫瘤血管靶向藥物為腫瘤治療提供了一個非細胞毒性的新途徑。噬菌體展示技術是一種高效獲取全新生物活性肽的實用技術[9]。將噬菌體展示技術應用于尋找特異結合腫瘤血管內皮細胞的短肽，為開發新的腫瘤血管靶向肽類藥物提供了新的方向。在之前的研究中，筆者已經利用噬菌體展示技術，篩選出了能與OAVECs靶向結合7肽TY-7，并證實表達此7肽的噬菌體能特異性結合OAVECs。本研究通過合成該肽，在體外細胞水平驗證了其與OAVECs結合的特異性，現報道如下。

材料與方法

1.實驗動物與材料：3周齡SPF級BALB/c-nu裸鼠，體質量13.8±0.7g，購自南方醫科大學動物實驗中心，SPF級動物房飼養，模擬正常晝夜節律光照，自由飲食。骨肉瘤UMR-106細胞株購自中國人民解放軍空軍軍醫大學，DMEM培養基、0.25%胰蛋白酶/0.02%乙二胺四乙酸(0.25% Trypsin/0.02% EDTA)、Ⅱ型膠原酶、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)及新生小牛血清(newborn calf serum，NBCS)購自美國Gibco公司，Ⅰ型鼠尾膠原購自廣州威佳公司，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)購自上海基因公司，抗細胞Ⅷ因子相關抗原兔多抗工作液、羊抗兔IgG、抗生物素-過氧化物酶(ABC)及DAB試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司，青霉素及鏈霉素購自華北制藥有限公司。側鏈保護的20種L型9-芴基甲氧羰基(Fmoc)氨基酸、1-羥基苯并三唑(HOBt)、固相載體 9-芴基甲氧羰基亮氨酰-2-氯三苯基(Fmoc-Leu-2-Cl-Trt resin)樹脂、N,N′-異丙基碳二亞胺(DIC)購自廣州百奧肽公司，異硫氰酸熒光素(FITC)購自美國Sigma公司。

2.OAVECs特異性結合肽的合成及純化：采用Fmoc固相合成TY-7，使用制備型高效液相儀分離純化后于N端標記一個FITC基團。FITC-TKPDKGY(FITC-TY-7)成品使用檢測型HPLC儀和質譜儀進行分析鑒定。

3.UMR-106細胞的培養和骨肉瘤動物模型的構建：UMR-106細胞使用含10% NBCS的RPMI1640培養基，在飽和濕度、95%O2和5%CO2及恒溫37℃的條件下常規培養。取對數生長期的UMR-106細胞，用胰酶消化后，PBS漂洗兩遍，使用無血清RPMI1640培養基制成濃度為108/ml的動物模型接種細胞懸液。選取健康活躍裸鼠，消毒后于裸鼠左側腋下皮下注射UMR-106細胞懸液0.1ml。造模1周后即可成瘤，3周后腫瘤直徑可達1cm。

4.原代培養：正常血管內皮細胞：頸椎脫臼處死裸鼠，無菌條件下迅速打開胸腹腔取出主動脈，PBS液沖凈血液，剝除血管周圍結締組織，加入膠原酶37℃消化30min。收集消化后的液體離心(1000r/5min)棄上清，加入培養基(低糖型DMEM、20%FBS、15U/ml肝素、2ng/ml VEGF、青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml)重懸沉淀后種植于Ⅰ型鼠尾膠原包被的培養皿中。2h后待內皮細胞貼壁后換液去除污染的成纖維細胞。待細胞生長分裂融合成單層、鋪滿皿底后傳代。骨肉瘤血管內皮細胞：在無菌條件下，將荷瘤裸鼠頸椎脫臼處死切取腫瘤，顯微鏡下分離腫瘤內血管，后續處理與原代培養正常血管內皮細胞相同。

5.血管內皮細胞的免疫組化鑒定：取生長良好的OAVECs、AECs細胞爬片，漂洗后使用4%多聚甲醛固定15min。再次漂洗后加入3%H2O2封閉10min。非免疫血清室溫孵育10min，洗片后加入50μl一抗(兔源抗Ⅷ因子相關抗原多抗工作液)4℃過夜。再次洗片后加入50μl二抗(生物素標記羊抗兔IgG工作液)溫育30min。最后洗片2次后加入ABC溶液37℃孵育15min，DAB試劑盒顯色。空白對照組使用PBS液代替一抗。封片置于鏡下觀察3個代表性視野，計數100個細胞得出陽性率。

6.FITC-TY-7與OAVECs特異性結合的檢測：(1)熒光顯微鏡：取生長良好的UMR-106、AECs及OAVECs細胞爬片，漂洗固定后避光加入5μmol/L的FITC-TY-7，37℃孵育30min。充分漂洗、中性甘油封片后熒光顯微鏡觀察。另取OAVECs與單純FITC基團作用作為對照組。(2)流式細胞儀：取生長良好的UMR-106、AECs及OAVECs細胞懸液分別加入流式細胞儀上樣管，離心棄上清后加入1～2滴PBS液稀釋。每種細胞均分別避光加入FITC-TY-7、單純FITC基團和PBS液室溫孵育30min。最后，PBS液稀釋至上樣管的2/3，輕振試管后再次離心棄上清，固定后檢測。

結 果

1.FITC-TY-7的合成純化：FITC-TY-7的純度為98.71%，進行質譜鑒定并測定相對分子質量為1197.3(圖1)。

圖1 FITC-TY-7質譜鑒定結果圖

2.原代培養：腫瘤血管內皮細胞于種植后第4天即可見到明顯的內皮細胞集落，正常血管內皮細胞則第6天可見細胞集落。OAVECs和AECs形態上無明顯差別，呈多角形、短梭形或不規則形，核清晰，呈橢圓形或圓形。兩種細胞均生長迅速，約7～9天后細胞匯合即生長減緩。傳至3～4代時，細胞開始逐漸不再貼壁，數目減少，停止生長，變性變形直至死亡。

3. 免疫組化鑒定：Ⅷ因子免疫組化顯示AECs和OAVECs胞質均呈黃褐色著色，AECs陽性細胞率為97.3%，OAVECs陽性細胞率為98.7%，而陰性對照組無特殊顯色(圖2)。

圖2 AECs和OAVECs的Ⅷ因子免疫組化鑒定(×200)

4.FITC-TY-7與OAVECs特異性結合的檢測：(1)熒光顯微鏡：OAVECs與FITC-TY-7作用后細胞表面熒光較強且清晰，顯示明確結合；而AECs及UMR-106與FITC-TY-7作用后熒光微弱模糊且與背景熒光一致，可認為此兩種細胞與FITC-TY-7無特異性結合(圖3)。(2)流式細胞儀：OAVECs與FITC-TY-7作用時，熒光標記的陽性細胞比例達89.54%；而AECs和UMR-106與FITC-TY-7作用時，熒光標記細胞比例分別為0.27%和0.22%(圖4)。單純FITC基團分別與3種細胞作用時，熒光標記細胞比例均<1.00%。

圖3 FITC-TY-7作用后熒光顯微鏡成像(×100)

圖4 流式細胞儀檢測細胞與FITC-TY-7的結合

討 論

血管在惡性腫瘤進展中起著至關重要的作用，腫瘤生長、轉移、復發時必須打開“血管生成開關”，才能誘導腫瘤生長至1～2mm[10]。幾乎所有的惡性腫瘤都具有持續的血管生成能力，這是侵襲性的重要基礎[7]。近年來，傳統細胞毒性抗腫瘤藥物的獲得性耐藥引發了對更具針對性的新治療策略的探索，腫瘤微環境被認為是重要的潛在治療靶點，其中最關鍵的是抗血管治療[11]。從傳統的以腫瘤細胞為中心的治療策略轉向抗血管治療模式，開辟了腫瘤治療的新領域[12]。腫瘤抗血管治療并不是直接通過細胞毒性針對腫瘤細胞，而是通過破壞血管實現阻斷氧氣、生長因子和營養的供應[13]。越來越多的研究表明，抗血管藥物以腫瘤血管內皮細胞為攻擊目標，直接針對已建立但異常的腫瘤血管系統，以腫瘤優先的方式迅速阻斷血流，導致腫瘤內快速廣泛的缺氧和腫瘤細胞死亡[14]。腫瘤血管內皮細胞基因穩定性較好，同質性強，標志物穩定，可以有效避免耐藥。另外，靜脈應用抗血管藥物可直接作用于腫瘤血管內皮細胞，從而提高藥效，降低耐藥性，減少不良反應[15]。與傳統治療方法比較，直接靶向腫瘤血管可以應用于多種腫瘤，在數小時內達到治療效果[16]。

多項研究證實通過血栓形成選擇性阻斷腫瘤血管可有效地殺死腫瘤，延長晚期患者的生存期[13,17]。在過去的幾十年里，已經開發出數種專門阻斷腫瘤血管的治療方法，可在數小時或數天內破壞腫瘤血管系統，降低血管密度，抑制腫瘤血流，導致廣泛的腫瘤壞死[18～20]。血管靶向化療有望為惡性腫瘤治療帶來革命性的變化，但是如何尋找特異性結合腫瘤血管內皮細胞的基團至關重要。Bussolati等[21]通過噬菌體展示技術獲得了親和腎腫瘤血管內皮細胞的噬菌體克隆CVGNDNSSC，根據序列合成短肽并證實該肽可特異性結合腎腫瘤血管內皮細胞而不與正常血管及其他腫瘤的血管內皮細胞結合。Arap等[22]同樣利用噬菌體展示技術得到了能與前列腺腫瘤血管靶向結合的短肽SMSIARL。而Sharma等[23]則更進一步，把腫瘤血管導敏肽(CGKRK)與促凋亡肽(KLAKLAK)結合制成納米顆粒，在膠質母細胞瘤和乳腺癌的治療中顯示出良好的效果。

骨肉瘤生長侵襲嚴重依賴血管的形成，針對腫瘤血管系統的治療具有廣闊的前景，有望成為克服傳統大劑量化療弊端的新策略。為得到可特異性結合OAVECs的低分子基團，管明強等[24]利用噬菌體展示技術獲取了能靶向結合UMR-106荷瘤裸鼠腫瘤血管的噬菌體(TKPDKGY)，并通過該單克隆噬菌體初步驗證了其結合的特異性。本研究中，筆者進一步根據此噬菌體的序列合成了短肽TY-7并標記FITC，在體外細胞水平通過熒光顯微鏡及流式細胞儀對其與OAVECs的結合特異性進行了驗證。熒光顯微鏡顯示TY-7可靶向結合OAVECs，但與正常血管內皮細胞和骨肉瘤細胞無明顯結合。流式細胞儀則進一步證實TY-7與OAVECs結合率(89.54%)遠高于與UMR-106(0.27%)和AECs(0.22%)，說明TY-7能高度與OAVECs特異性結合。以上實驗通過定性和定量兩方面驗證了TY-7具備與OAVECs靶向結合的能力，同時并不與骨肉瘤細胞及裸鼠正常血管內皮細胞結合。

在靶向診療的研究中，能否得到可高選擇性結合靶點的基團至關重要。本研究中由噬菌體展示技術獲得的短肽TY-7具有在體外細胞水平高度特異結合OAVECs的能力。在此基礎上，筆者將進一步實現TY-7與效應分子結合，研究其對骨肉瘤的靶向治療作用，或與造影劑結合，評價其診斷示蹤作用，為骨肉瘤血管靶向診療提供實驗基礎。