靶向MSTN基因shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

王麗俊 鈕利喜

肌肉生長抑制素(myostatin，MSTN)，簡稱抑肌素，又名生長分化因子8(GDF-8)，是TGF-β超家族成員之一，其功能主要是作為一種骨骼肌生長的負(fù)調(diào)控因子，限制肌肉超常發(fā)育[1]。該基因的缺失或突變會使肌細(xì)胞增生和肥大，機(jī)體表現(xiàn)為雙肌性狀[2,3]。對MSTN基因的深入研究在畜牧業(yè)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義。近年來，研究發(fā)現(xiàn)MSTN不僅可調(diào)控肌肉生長發(fā)育，在肌肉穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，而且還影響脂肪形成和骨骼發(fā)育，并與胰島素敏感度有關(guān)[4～6]。因此，有關(guān)MSTN基因與多種疾病的關(guān)系及其在機(jī)體代謝中的作用受到廣泛關(guān)注。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象[7]。該技術(shù)可以簡便、快速、高效、特異性地抑制基因的表達(dá)，因此受到了各個領(lǐng)域研究者的重視。該技術(shù)主要應(yīng)用于探查基因功能、基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究等領(lǐng)域。本研究旨在構(gòu)建具有良好干擾效果的pSIREN-MSTN-shRNA表達(dá)載體，為后續(xù)通過RNA干擾技術(shù)調(diào)控MSTN基因表達(dá)以改善和治療MSTN相關(guān)疾病奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1.主要試劑和實(shí)驗(yàn)材料：限制性核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ(1010S和1040S，日本TaKaRa公司)；T4 DNA連接酶(2011A，日本TaKaRa公司)；質(zhì)粒小量提取試劑盒(D1100，北京索萊寶科技有限公司)；SYBR?Premix Ex Taq TMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒(RR820A，日本TaKaRa公司)；GDF-8抗體(sc-134345，美國Santa Cruz公司)；GAPDH抗體(MB001，南京巴傲得生物科技有限公司)；m-lgGk BP-HRP二抗(sc-516102，美國Santa Cruz公司)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(D2500-01，美國Omega Bio-Tek公司)；通用RT-PCR試劑盒(M-MLV)(RP1100，北京索萊寶科技有限公司)；RIPA組織/細(xì)胞裂解液(R0020，北京索萊寶科技有限公司)；shRNA序列合成、引物序列合成(深圳華大基因公司)。健康ICR小鼠購自山西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，雄性，6～8周齡，20只。

2.MSTN shRNA序列的設(shè)計與合成：根據(jù)Genbank上已公布的小鼠MSTN基因的mRNA序列(NM_010834.3)，選用Invitrogen的BLOCK-iTTMRNAi Designer軟件，在線設(shè)計siRNA序列并挑選出3條可能具有良好干擾效果的siRNA序列，設(shè)計成包含正義鏈、loop環(huán)、反義鏈、轉(zhuǎn)錄終止信號和酶切位點(diǎn)的shRNA寡核苷酸單鏈[8]。其序列詳見表1。

3.pSIREN-MSTN-shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建：將設(shè)計合成的shRNA引物進(jìn)行退火形成雙鏈，同時使用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ對載體pSIREN-DNR-DsRed-Express進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，與退火產(chǎn)物相連接(T4 DNA 連接酶，16℃水浴過夜)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉素(100μg/ml)的固體LB平板上，37℃恒溫培養(yǎng)。挑取陽性單菌落于5ml含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～12h，提取質(zhì)粒，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，鑒定重組質(zhì)粒。將構(gòu)建好的質(zhì)粒命名為pSIREN-M664、pSIREN-M791和pSIREN-M819。

表1 設(shè)計合成的shRNA序列

4.shRNA表達(dá)載體導(dǎo)入小鼠體內(nèi)：將6～8周齡的小鼠隨機(jī)分為4組：pSIREN-M664實(shí)驗(yàn)組、pSIREN-M791實(shí)驗(yàn)組和pSIREN-M819實(shí)驗(yàn)組及陰性對照組(NC組)。采用肌內(nèi)注射的方法將重組質(zhì)粒載體導(dǎo)入小鼠體內(nèi)。取100μg去內(nèi)毒素質(zhì)粒載體稀釋于200μl的PBS(pH 7.4)溶液中，吸入1ml注射器，并將稀釋液注入小鼠右后腿肌肉[9,10]。注射3天后，采用斷頸法處死小鼠，取其右后腿部肌肉組織，用于下一步實(shí)驗(yàn)。

5.qRT-PCR檢測干擾后MSTN的mRNA表達(dá)水平：取各組小鼠肌肉組織，通過Trizol法提取總RNA，按照通用RT-PCR試劑盒說明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA，利用SYBR法的real-time PCR試劑盒，以GAPDH為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)。用于定量檢測的MSTN引物序列和GAPDH的引物序列如下：MSTN-上游引物為AACCTTCCCAGGACCAGGAGAA；MSTN-下游引物為GGCTTCAAAATCGACCGTGAGG；GAPDH-上游引物為ATCACTGCCACCCAGAAGACTG；GAPDH-下游引物為ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG。qRT-PCR反應(yīng)體系為25μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)12.5μl、上下游引物(10μmol/L)各1μl、模板cDNA 2μl、ddH2O 8.5μl。每份樣品重復(fù)3次，結(jié)果采用 2-ΔΔct法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

6.Western blot法檢測干擾后MSTN的蛋白質(zhì)表達(dá)：各組取一定量的小鼠肌肉組織，充分剪碎后置于1.5ml的無菌EP管中，按照每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入RIPA組織/細(xì)胞裂解液，混合均勻，冰浴30min后，12000r/min、4℃離心30min，上清液即為所提取的總蛋白。調(diào)節(jié)上樣量至每孔60μg蛋白樣品進(jìn)行12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入GDF-8一抗工作液(1∶200稀釋)和GAPDH一抗工作液(1∶10000稀釋)孵育，4℃過夜。TBST漂洗3次，加入HRP標(biāo)記的二抗工作液(1∶1000稀釋)后37℃ 孵育1h。TBST漂洗3次，ECL顯色。

7.統(tǒng)計學(xué)方法：運(yùn)用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理。采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.pSIREN-DNR-DsRed-Express載體的酶切：對載體pSIREN-DNR-DsRed-Express進(jìn)行BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切，酶切后的質(zhì)粒載體條帶大小正確(圖1)。

圖1 pSIREN-DNR-DsRed-Express載體的酶切結(jié)果M.DL5000 DNA Marker；1.未經(jīng)酶切的載體;2.經(jīng)過酶切的載體

2.pSIREN-MSTN-shRNA表達(dá)載體的鑒定：由于插入的shRNA片段較小，不能通過PCR法或酶切鑒定，因此，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒送往上海生工生物公司測序鑒定，測試報告中的插入序列與所設(shè)計的shRNA引物序列完全一致，表明pSIREN-MSTN-shRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功，可以用于后續(xù)的干擾實(shí)驗(yàn)。測序結(jié)果詳見圖2。

3.shRNA干擾后MSTN的mRNA表達(dá)水平檢測：利用qRT-PCR法檢測干擾后小鼠肌肉組織中的MSTN mRNA表達(dá)水平，其檢測結(jié)果詳見圖3。從條形圖中可以看出3個干擾RNA實(shí)驗(yàn)組MSTN mRNA表達(dá)都有所降低，pSIREN-NC組與其他各組MSTN mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。干擾質(zhì)粒組pSIR-M664、pSIR-M791和pSIR-M819與對照組中MSTN基因mRNA相對表達(dá)量比較，分別降低65%、61%和71%。

圖3 MSTN的mRNA表達(dá)水平檢測與pSIREN-NC組比較，*P<0.01

4.免疫印跡分析(Western blot, WB)：WB法檢測干擾后的 MSTN蛋白表達(dá)水平，結(jié)果詳見圖4。3個MSTN shRNA實(shí)驗(yàn)組較對照組的MSTN蛋白表達(dá)量有一定程度的減少，表明pSIR-M664、pSIR-M791和 pSIR-M819均能降低MSTN蛋白的表達(dá)。

圖4 MSTN的蛋白表達(dá)水平檢測A.Western blot法：1為shRNA陰性對照組，2～4分別為pSIREN-M664、pSIREN-M791和pSIREN-M819 shRNA表達(dá)載體干擾組；B.灰度分析MSTN蛋白質(zhì)相對表達(dá)量;與pSIREN-NC組比較，*P<0.01

討 論

小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)是能夠引起RNA干擾的小片段雙鏈RNA分子。siRNA可以整合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中，隨后雙鏈被分開，其中一條鏈在RISC作用下特異性與靶mRNA識別結(jié)合，通過降解mRNA來阻斷靶基因的表達(dá)[11]。siRNA阻斷基因的表達(dá)具有高效性、特異性、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[12]。但siRNA的半衰期短，而shRNA可以克服這一缺點(diǎn)，能夠持續(xù)性地干涉靶基因[13]。因此，與直接合成siRNA比較，利用shRNA表達(dá)載體表達(dá)來研究基因沉默要更為有效。對于RNA干擾載體，目前已經(jīng)開發(fā)了許多病毒和非病毒載體，但病毒載體的安全性問題仍然存在。與使用病毒載體的方法比較，使用質(zhì)粒DNA的基于非病毒載體的方法可能為誘導(dǎo)RNAi的更安全的方法[14]。因此，本研究選用pSIREN-DNR-DsRed-Express質(zhì)粒構(gòu)建shRNA表達(dá)載體，以期得到具有顯著干擾效果的shRNA分子，為后續(xù)通過RNA干擾技術(shù)調(diào)控MSTN基因表達(dá)來改善和治療MSTN相關(guān)疾病奠定基礎(chǔ)。

MSTN是可以調(diào)控肌肉生長和發(fā)育的重要功能基因，其基因序列，尤其是外顯子序列，在不同物種間高度同源，十分保守。MSTN主要在骨骼肌中表達(dá)，在心肌、脂肪組織、淋巴組織、肺部、脾臟和小腸等其他組織或器官中也有不同程度的表達(dá)[15]。隨著不斷深入的研究，發(fā)現(xiàn)MSTN基因除了可以負(fù)調(diào)控肌肉生長外，在脂代謝、糖代謝、骨形成和骨吸收中也起著重要的調(diào)節(jié)作用，具有廣闊的應(yīng)用前景和商業(yè)價值。MSTN基因的敲減或敲除有助于提高家畜家禽酮體的瘦肉率，從而提高飼料利用率、降低飼養(yǎng)成本，促進(jìn)家畜家禽的肌肉生長和肉類生產(chǎn)[16]。近年來，對家畜家禽MSTN基因做了大量研究，已有文獻(xiàn)報道了牛、山羊、綿羊、豬、雞、鴨的shRNA真核表達(dá)載體和慢病毒載體或腺病毒載體，但其大多是在細(xì)胞水平中驗(yàn)證載體干擾效果[17～20]。在醫(yī)學(xué)研究中MSTN基因已被確立為治療肌肉萎縮、肌營養(yǎng)不良等肌變性疾病的一個新的靶標(biāo)分子。通過抑制MSTN的表達(dá)來改善肌肉萎縮。此外，深入探討MSTN基因?qū)θ祟愄悄虿　⒎逝职Y、骨質(zhì)疏松癥及其他慢性疾病甚至癌癥惡病質(zhì)的治療具有重要意義。MSTN基因的siRNA、miRNA、MSTN抗體、MSTN抑制劑等藥物方面的研究，在臨床醫(yī)學(xué)上體現(xiàn)出很高的應(yīng)用價值。

綜上所述，本研究運(yùn)用qRT-PCR和WB法分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平來驗(yàn)證所設(shè)計和構(gòu)建的pSIREN-MSTN-shRNA表達(dá)載體在小鼠體內(nèi)的干擾效果，為下一步建立動物模型研究MSTN的siRNA質(zhì)粒治療效果奠定工作基礎(chǔ)。