核受體Nur77對卵巢癌細胞增殖轉移的影響及機制研究

姜 平 楊喜科 王秋宇

在婦科惡性腫瘤中卵巢癌的發生率和病死率均位居前列，早期的卵巢癌癥狀并不明顯，較少出現急性腹痛，且易與卵巢濾泡囊腫、黃體囊腫、闊韌帶肌瘤等其他疾病引起的癥狀混淆，因此不少缺乏體檢的患者在確診時腫瘤已進入晚期并發生轉移，包括蔓延至輸卵管、子宮、腹膜，嚴重時可進犯到結腸內發生梗阻，或者通過淋巴和血液循環發生遠端轉移，此時患者身體狀況日益虛弱，各類藥物療效不佳，導致生存率急劇下降。因此，研究卵巢癌侵襲轉移的機制，以此作為評價病情的指標，并為研制藥物提供作用靶點，是提高卵巢癌晚期患者生存率的有效手段[1]。

Nur77為孤兒受體超家族蛋白，在各種組織，在肺癌、胃癌、結腸癌和肉瘤等腫瘤中常存在過度表達，且對腫瘤細胞生長、增殖、侵襲、轉移均起到促進作用[2]。有研究報道，Nur77在卵巢上皮性癌組織中的表達明顯高于良性卵巢腫瘤、交界性腫瘤及正常的卵巢組織，而且表達水平隨著臨床病理分期的增加而上升，且隨訪發現Nur77陽性的患者術后3年的復發率明顯增加，確診時均為晚期且伴有轉移，提示Nur77可能與卵巢癌的復發和轉移密切相關[3]。有細胞研究表明，在SKOV3、HO-8910、HO-8910-PM和3AO等多種卵巢癌細胞中，具有高轉移性的HO-8910-PM細胞存在Nur77高表達[4]。據此，本研究以人高轉移性卵巢癌細胞HO-8910PM為研究對象，通過下調Nur77表達量或激活其活性，研究Nur77在卵巢癌發生侵襲轉移過程中所產生的作用和病理機制。

材料與方法

1.材料：(1)藥品與試劑：殼囊孢酮 B(美國Sigma-Aldrich公司)，Lipofectamine 2000轉染試劑、高糖DMEM培養基、特級胎牛血清、0.25%胰酶溶液(美國Gibco公司)，annexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)，GAPDH、p-Nur77、p-Akt、Cyclin D1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等兔抗人一抗以及羊抗兔二抗(英國Abcam公司)。TBST緩沖液、Triton X-100溶液、MMP-2、MMP-7、MMP-9 ELISA試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)，Transwell試劑盒(美國Corning公司)，pLV-U6-MCS-GFP-Puro(型號：LV008)慢病毒轉染載體試劑盒、M-MLV反轉錄酶、GoTaq?qPCR試劑盒、嘌呤霉素(美國Promega公司)，shNur77干擾序列 5′-AACTCCAAGTTGGACTATTCCTTAAGTTCTCTAAG GAATAG TCCA ACTTGGTTTTTTC-3′(美國Invitrogen公司)。(2)儀器:Thermo Forma 3951 細胞培養箱、Sorvall ST 40臺式離心機(美國Thermo 公司)，FACS Calibur 型流式細胞儀(美國BD公司)，iMark 680酶標儀、Western blot轉膜儀(美國Bio-rad公司)，IX71 倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。(3)細胞:人高轉移性卵巢癌細胞HO-8910PM、293T細胞株(美國ATCC生物資源中心)，Tran5α感受態細胞(法國Transgene公司)。

2.方法：(1)細胞的培養：將細胞接種于含10% FBS, 100U/ml青霉素，0.1g/L硫酸鏈霉素的高糖 DMEM培養基中，在37℃、飽和濕度、5% CO2、95% 空氣的細胞培養箱中培養。待細胞生長覆蓋約至 80%時，用0.25%胰酶消化傳代，并按5×104個/毫升密度接種于培養板或培養瓶內備用。(2)干擾質粒的克隆:將正、反義寡核苷酸鏈和反應緩沖液各1μl加進17μl 純化水，加熱至95℃，10min后自然冷卻至室溫。在37℃加入T4磷酸化酶作用30min使寡核苷酸鏈的5′端磷酸化。將LV008載體、寡核苷酸雙鏈、連接反應緩沖液、T4連接酶各1μl 加入6μl 純化水，室溫反應30min。冰浴中將50～100ng連接產物分別加入至50μl Tran5α感受態細胞中。輕輕旋轉混勻，冰浴30min，42℃水浴熱休克90s。快速將管轉移至冰浴中，冰浴2min。分別加入500μl LB培養基，37℃、150r/min振蕩培養40min。將150μl菌液涂布于含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB平板表面，室溫下放置，至液體吸收。倒置平板，轉移入37℃生化培養箱過夜培養。(3)慢病毒包裝:轉染前將培養好293T的細胞培養基更換為無血清培養基。向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(pLV-gene載體10μg，pGag/Pol載體5μg、pRev載體5μg、pVSV-G載體5μg)，與相應體積的Opti-MEM 混合均勻，調整總體積為 1.5ml。把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine 2000 進行混合，在室溫孵育20min后，液轉移至293T細胞的培養液中細胞培養箱中，6h后更換含血清培養基繼續培養48h。收集轉染后的293T 細胞上清液，于 4℃，4000×g離心10min，除去細胞碎片。把病毒液樣品加進濾杯插到濾過液收集管中，5000×g離心15min，至濃縮病毒樣品的體積。將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，可在4℃保存1周，或-80℃長期保存。(4)干擾穩定細胞系的構建:從冰箱取出并在37℃水浴中快速融化病毒，用新鮮的完全培養基稀釋成所需濃度，準備好HO-8910PM 細胞，研究組加入shNur77干擾序列載體，對照組加入慢病毒空載體，加入聚凝胺 37℃培養過夜。第2天，吸去含病毒的培養液，換上新鮮的完全培養液，繼續培養。第3天，換上含適當濃度嘌呤霉素的培養液，篩選穩定轉導的細胞株。10～12天后可獲得穩定表達目的蛋白的細胞克隆。熒光顯微鏡下拍照觀察GFP陽性率>95%。(5)細胞的分組處理：按不同的實驗細胞和處理方式設對照組、研究組、Csn-B組、Csn-B(Nur77-/-)組共4個組別進行研究，詳見表1。(6)細胞周期的檢測：將細胞接種于6孔板中培養，分組處理24h，棄去培養液，PBS洗滌后加入用0.25%胰酶(不含EDTA)于37℃進行消化，然后加入500μl 75%的預冷乙醇，4℃固定過夜，預冷PBS洗滌后離心，吸棄上清液，加入100μl RNase A，37℃水浴30min，加入PI染液400μl，4℃避光保存30min，流式細胞儀上檢測細胞周期。(7)蛋白表達量的檢測:在6孔板中將培養好的細胞分組處理24h，用PBS 沖洗2次，加入預冷細胞裂解液作用30min， 12000r/min 4℃離心15min，沉淀細胞碎片等雜質，取上清液，BCA法測定蛋白量。用含12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上，5%BSA封閉90min，加入稀釋好的一抗，在4℃條件下孵育過夜。TBST洗膜后，加入二抗，37℃孵育1h，再洗滌2次，ECL試劑暗室顯影，采用成像系統軟件分析膠片中條帶的灰度面積，以內參GAPDH基準計算各待測蛋白的相對表達量。(8)基質金屬蛋白酶的檢測:在6孔板中將培養好的細胞分組處理24h，吸取上清液，3000×g離心10min去除細胞殘屑，按試劑盒說明書操作檢測，以對照組為參照，比較各藥物組細胞培養液中MMP-2、MMP-7、MMP-9的相對分泌量。(9)細胞轉移和侵襲力的檢測:將對數生長期的細胞10cm接種于培養皿中，分組處理24h。將Transwell小室架于配套的24孔板上，按1∶7比例將50mg/L Matrigel膠與無血清DMEM培養液混合均勻，取100μl加至小室中央，置于37℃培養箱中孵育6h，然后棄去殘余液體。將細胞按2×105個/孔接種至Transwell小室內，下小室加入800μl含10%胎牛血清DMEM培培養24h后，棄去培養液，無水乙醇固定細胞10min，0.1% 結晶紫染色30min，洗滌后在顯微鏡下觀察，隨機統計從中間和四周5個視野的細胞數，求其平均值及標準差。

表1 細胞的分組處理

結 果

1.慢病毒載體的轉染:從圖1A 可觀察到對照組和研究組的細胞在熒光顯微鏡下均可觀察到標記蛋白GFP的綠色熒光，兩組的熒光強度比較差異無統計學意義；圖1B可見對照組Nur77的WB顯影條帶與研究組比較明顯較深；圖1C柱狀圖所示研究組的Nur77相對表達量低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，表明慢病毒載體已轉染成功，已達到下調 Nur77表達量的目的。

圖1 慢病毒載體轉染HO-8910PM 細胞A.轉染后對照組與研究組的熒光成像(×200)；B.轉染后對照組與研究組Nur77的WB顯影條帶；C. 轉染后Nur77的相對表達量比較;與對照組比較，*P<0.05

2.細胞周期分布的檢測：流式細胞法檢查各組細胞在不同細胞周期的數量分布，如圖2A所示，圖中紅色部分表示細胞處于G0和G1期，黃色部分表示處于S期，藍色部分表示處于G2期和M期。圖2B所示為處于各個周期的細胞數量百分比， S、G2和M期的比例依次為：研究組

3.p-Nur77、p-Akt、Cyclin D1含量的檢測：WB的顯影條帶如圖3A所示， p-Nur77、p-Akt、Cyclin D1的三者含量呈正相關變化，含量依次為研究組

圖2 各細胞周期的細胞數量比例A.流式細胞法檢測細胞周期；B.處于不同周期的細胞數量比例；與對照組比較，*P<0.05;與研究組比較，#P<0.05

圖3 WB檢測p-Nur77、p-Akt、Cyclin D1的表達量A.各蛋白的WB顯影條帶；B.各蛋白相對表達量的比較;與對照組比較，*P<0.05；與研究組比較，#P<0.05

4.細胞轉移相關蛋白含量的檢測：WB的顯影條帶如圖4A所示，E-cadherin的含量依次為研究組> Csn-B(Nur77-/-)組>對照組>Csn-B組，而N-cadherin和Vimentin的含量則與之相反，依次為研究組

圖4 WB檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的含量A.各蛋白的WB顯影條帶；B.各蛋白相對表達量的比較;與對照組比較，*P<0.05；與研究組比較，#P<0.05

5.MMPs分泌量的檢測：ELISA檢測結果如圖5所示，MMP-2、MMP-7和MMP-9的相對含量依次為研究組

圖5 MMP-2、MMP-7和MMP-9分泌量的比較與對照組比較，*P<0.05；與研究組比較，#P<0.05

6.細胞轉移侵襲能力的檢測：圖6A所示為穿過Transwell小室轉移至培養板孔內的細胞；圖6B所示為采用目鏡微尺的細胞計數結果，培養板孔內的細胞數量依次為研究組< Csn-B(Nur77-/-)組<對照組< Csn-B，與對照組比較，各藥物組細胞數量差異均有統計學意義(P<0.05)。

討 論

目前發現的在人孤兒核受體(orphan nuclear receptor)有25個成員，之所以成為孤兒受體，是因為它們特異性的體內配體至今仍未確定。Nur77 (也稱為TR3或NGFI-B)就是其中1個孤兒核受體，其定位于人12號染色體, 由NR4A1編碼, 是類固醇/甲狀腺受體/視黃酸受體超家族成員。NR4A家族包含3個成員，即Nur77(NR4A1)、Nurr1(NR4A2)和Nor-1(NR4A3), 它們在結構上都具有典型的核受體特征。在人乳腺癌、肺癌、結腸癌、胰腺癌、卵巢癌等各種惡性腫瘤中均存在Nur77高表達，提示Nur77可能參與腫瘤的發生、發展過程。研究表明，各種有絲分裂原都可以顯著提高Nur77的蛋白表達，表皮生長因子、血清等促有絲分裂刺激物能夠強烈地誘導Nur77表達, 從而促進細胞增殖。轉染外源Nur77質粒能夠加速細胞周期進程, 增加S/G2期的細胞數量, 而抑制內源Nur77表達水平則明顯抑制腫瘤細胞的增殖速度。Nur77高水平表達是許多腫瘤生長、增殖、轉移和侵襲的關鍵因素之一[5]。

圖6 Transwell法檢測細胞的轉移侵襲能力A.轉移至培養板孔內的細胞(×200)；B.細胞計數結果的比較;與對照組比較，*P<0.05；與研究組比較，#P<0.05

Nur77在卵巢上皮性癌組織中的表達明顯高于良性卵巢腫瘤、交界性腫瘤及正常的卵巢組織，而且表達水平隨著臨床病理分期的增加而上升，提示Nur77可能與卵巢癌的轉移和侵襲密切相關。卵巢癌的轉移包括以下4種方式：(1)直接轉移：當腫瘤發展到與周圍的組織器官發生黏連，可直接蔓延至輸卵管、子宮、腹膜，嚴重時可進犯到結腸表面。(2)植入轉移：當腫瘤細胞不斷增殖穿破包膜，脫落并擴散至腹腔或盆腔內，進而依附腔內臟器繼續生長。(3)淋巴轉移：卵巢癌可通過卵巢門血管轉移到腹主動脈旁淋巴結和腹股溝淋巴等組織。(4)血性轉移：通過血液循環系統轉移至肺部、肝臟、骨等部位，各種方式的轉移和侵襲均涉及到腫瘤細胞的迅速增殖，細胞形態轉變以及產生各種能夠分解正常組織基質的分子，包括各類基質金屬蛋白酶(MMPs)[6]。

Cyclin D1是細胞周期蛋白中最重要的一員，Cyclin D1過度表達可使細胞增殖失控，迅速從G1期進入S期，進而促進腫瘤細胞的存活、生長、轉移和代謝因而其在腫瘤學研究領域常作為一個觀察腫瘤細胞增殖狀況的有效指標[7，8]。研究表明Cyclin D1的表達受到上游PI3K/Akt通路的調控，當Akt經過第二信使PI3K磷酸化生成p-Akt后，可延長下游的信號通路蛋白Cyclin D1的半衰期，從而促使細胞增殖加快乃至發生癌變[9]。有研究者通過細胞實驗發現在乳腺癌細胞中Nur77可介入PI3K/Akt的調控，干擾Nur77的表達可對PI3K/Akt通路產生抑制作用而促進腫瘤細胞凋亡[10]。本研究結果顯示，下調HO-8910PM細胞Nur77的表達量可抑制Akt的磷酸化激活，降低Cyclin D1的表達，遏制細胞周期的進展，最終抑制HO-8910PM細胞的生長和增殖[11]。

上皮-間質轉化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)是上皮源性腫瘤發生轉移的首要階段，在極性上皮細胞逐漸向間質細胞表型轉化的過程中, 細胞的遷移、侵襲能力不斷加強，主要發生機制為不同亞型鈣黏附蛋白(cadherin)之間的轉換[12]。其中E-cadherin是維持上皮細胞之間的連接黏附，保持細胞聚集功能的主要分子，因而在正常細胞組織中保持高水平表達，若其表達水平降低，則可導致細胞復合體解離; 而cadherin 另一個亞型N-cadherin 的作用則與之相反，其在某些生長因子的作用下可使細胞復合體解離，在腫瘤細胞侵襲、浸潤、轉移的過程中起到促進作用[13,14]。波形蛋白(Vimentin)是中間絲蛋白家族的主要成員，其多聚體是與肌動蛋白和微管蛋白共同構成細胞骨架蛋白的關鍵成分，研究發現在癌細胞侵襲和遷移的過程中，游離Vimentin含量的不斷增加，意味著細胞骨架蛋白發生解離，是EMT開始進展的信號[15]。本研究結果表明，下調HO-8910PM細胞中Nur77的表達量可抑制E-cadherin向N-cadherin的轉化，并維持Vimentin的穩定，從而抑制卵巢癌細胞的侵襲與轉移能力[16,17]。

MMPs 是一個能夠降解和重塑細胞外基質的蛋白水解酶家族，在正常組織中的表達和活性相對較低，但在發生炎性反應、骨質疏松、腫瘤侵襲轉移等病變的時候，其含量均會顯著增加。大量臨床研究表明鼻咽癌的轉移與MMPs的過度表達分泌密切相關，包括MMP-1、2、7、9、13、14等眾多家族成員，涉及細胞間質、基膜膠原蛋白的降解以及骨質的侵蝕[18]。在各種 MMPs 成員中MMP-2、MMP-7和MMP-9與卵巢癌發生侵襲轉移的關系最為密切，它們主要降解的底物為Ⅳ型膠原、明膠、彈力蛋白等組織基膜的主要成分，而基膜的降解是腫瘤細胞進行侵襲與轉移首要階段[19]。因此本研究選用MMP-2、MMP-7和MMP-9作為檢測指標，并選用富含層黏連蛋白、Ⅳ型膠原的Matrigel膠作為Transwell實驗培養皿的基質進行研究。本研究結果表明，下調HO-8910PM細胞Nur77的表達量，培養基中的MMP-2、MMP-7和MMP-9含量顯著逐漸減少，結合Transwell實驗結果分析，下調Nur77的表達量能夠抑制HO-8910PM細胞分泌MMP-2、MMP-7和MMP-9,降低其侵襲轉移的能力。