S100A4和S100A6在成骨細胞和破骨細胞分化中表達及意義

袁赤亭 洪 盾 朱麗君 李紫嫣

骨質疏松是不同原因引起的，以單位體積內骨量減少為特點的代謝性骨病變。臨床表現以骨骼疼痛、易于骨折為特征；病理解剖可見骨小梁變細、 斷裂、 稀疏萎縮，骨皮質多孔、變薄[1]。骨是復雜的組織，不斷地通過破骨細胞吸收舊骨和成骨細胞形成新骨，保持動態平衡。破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨形成是決定骨量兩個重要的因素；如兩者失衡,會導致骨質疏松、骨軟骨病、骨硬化病等骨相關疾病[2]。

研究報道S100蛋白與成骨細胞分化方面有著密切關系[3]。S100蛋白在1965年被首先發現，因其在中性飽和硫酸銨中溶解率100%而命名，相對分子質量為9～13kDa，是一種鈣結合蛋白家族，只在脊椎動物中表達。具有兩個EF手模序結構，分別位于羧基端和氨基末端；氨基末端EF手是這個家族所特有的，由于S100蛋白家族成員具有不同結構，導致具有不同功能[4]。研究發現S100蛋白既具有細胞內功能，也有細胞外功能作用[5]。Duarte等[6]研究發現S100A4蛋白在成骨誘導分化及礦物質吸收過程中起負性調節作用。Hong等[7]研究發現S100蛋白隨著地塞米松濃度作用而表達升高，主要發現S100A4和S100A6等。S100A4和S100A6在骨代謝方面是研究的焦點，但S100A4和S100A6蛋白對骨代謝的作用機制未闡明，有待于進一步研究和探索。因此本研究探討S100A4和S100A6 mRNA與成骨和破骨細胞分化的相關性研究。

材料與方法

1.實驗材料與試劑：EDTA(上海捷瑞生物工程有限公司)，胰酶(美國Sigma-Aldrich公司)，TRIzol(美國Life Technologies公司)，7300 real time PCR 系統(美國Applied Biosystems公司)，SYBR Green Masrer Mix(瑞士Roche公司)，引物(上海捷瑞生物工程有限公司)，反轉錄試劑盒(瑞士Thermo Scientific公司)。

2.MC3T3-E1細胞培養：將MC3T3-E1細胞培養在10%小牛血清的а-MEM培養液的培養瓶中，置于5%CO2及37℃保濕的溫箱中，定期換液，等細胞生長到密度為90%左右，吸出細胞培養液，用滅菌PBS清洗3次，加入適量含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化30～60s后，加入適量培養基終止消化，反復吹打細胞，使其細胞分散，將其移至離心管后，室溫1000r/min 5min，吸出上清液，加入適量培養基后，將其吹打成細胞懸液，以1∶2接種到新培養瓶中，置于5%CO2及37℃保濕的溫箱中培養。

3.茜素紅染色:MC3T3-E1細胞被分成成骨誘導組和對照組，等培養瓶中MC3T3-E1細胞生長密度為90%左右時，用 PBS 輕緩清洗細胞表面3次，胰酶消化、培養基終止、離心、收集，向離心管中加入適量新鮮培養基，吹散細胞后混勻，按1×105/ml密度接種到6孔板上，在有或無成骨誘導液的培養基中培養3、7、14和21天。棄去培養基，PBS清洗3次，用90%冰乙醇固定、PBS清洗3次，加入茜素紅染液，置于37℃溫箱中孵育10min。用無菌PBS輕緩清洗細胞表面3次，靜置5分鐘/次；顯微鏡下觀察、拍照，收集、整理。

4.堿性磷酸酶染色：MC3T3-E1細胞被分成成骨誘導組和對照組。等培養瓶中MC3T3-E1細胞生長密度為90%左右時，胰酶消化、培養基終止、離心，向離心管中加入適量新鮮培養基，吹散細胞后混勻，按1×105/ml密度接種到6孔板上，在有或無成骨誘導液的培養基中培養3、7、14和21天。棄去培養基，用無菌PBS輕緩清洗細胞表面3次，靜置5分鐘/次；用堿性磷酸酶試劑盒中固定液固定1min。用無菌PBS輕緩清洗細胞表面3次，靜置5分鐘/次；加入堿性磷酸酶染色液，置于37℃溫箱中孵育45min。用無菌PBS輕緩清洗細胞表面3次，靜置5分鐘/次；顯微鏡下觀察、拍照，收集、整理。

5.總RNA提取和real time RT-PCR:等培養的MC3T3-E1細胞密度及狀態均良好時，棄去培養基，用無菌PBS輕柔清冼細胞表面3次，用含有血清的新鮮培養基終止消化，在室溫下離心(1000r/min、5min)，再用無菌PBS清洗后離心，收集細胞。總RNA提取用TRIzol方法，具體提取過程根據試劑說明書。通過測量在260nm和280nm處吸光度RNA濃度和純度。根據反轉錄試劑盒說明書，用提取的1μl 總RNA反轉錄得到cDNA。通過7300 real time PCR 系統檢測目的基因mRNA表達情況，引物的設計詳見表1。PCR擴增是通過20μl混合體系(1μl cDNA和0.05μmol/L引物，10μl SYBR Green Masrer Mix)中完成，反應溫度條件如下：58℃反轉錄在2min,95℃反轉錄酶失活10min,40個循環擴增(95℃ 15s，60℃ 1min),根據熔解曲線分析判斷PCR結果的特異性。通過7300 real time PCR系統收集PCR結果數據。

6.RAW264.7細胞培養：將RAW264.7細胞培養在10%小牛血清的a-MEM培養液的培養瓶中，置于5%CO2及37℃保濕的溫箱中，等細胞生長到密度為90%左右，吸出細胞培養液，用滅菌PBS清洗3次，加入適量含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化30～60s后，顯微鏡下觀察，等見到細胞單層收縮突起出現空隙時，加入適量培養基終止消化，反復吹打細胞，使其細胞分散，將其移至離心管后，室溫1000r/min 5min，吸出上清液，加入適量培養基后，將其吹打成細胞懸液，以1∶2接種到新培養瓶中，置于5%CO2及37℃保濕的溫箱中培養。

表1 目的基因引物等相關情況

7.TRAP染色:RAW264.7細胞分成破骨細胞誘導組和對照組，按1×105/ml密度接種到6孔板上。RAW264.7細胞在有破骨細胞誘導液(50ng/ml RANKL和25ng/ml M-CSF)的培養基中培養1、3和5天時，去掉上清液，用 PBS 輕緩清洗細胞表面3次，加入多聚甲醛固定20min，然后TRAP避光染色2h，用 PBS 輕緩清洗細胞表面3次，顯微鏡下觀察、拍照，收集、整理及統計圖片。

8.總RNA提取和real time RT-PCR:RAW264.7細胞分成破骨細胞誘導組和對照組，按1×105/ml密度接種到6孔板上。RAW264.7細胞在有破骨細胞誘導液(50ng/ml RANKL和25ng/ml M-CSF)的培養基中培養1、3和5天時，收集各時間段細胞，引物的設計詳見表1，通過real time RT-PCR的方法檢測S100A4、S100A6及TRAP mRNA等表達情況，收集、整理和統計數據(表2)。

表2 目的基因引物相關情況

結 果

1.茜素紅染色結果:成骨誘導組MC3T3細胞誘導3和7天時未出現鈣結節，14天時出現散在較小不典型結節，21天時出現數量較多以及直徑較大典型鈣結節。對照組培養過程中始終未出現典型鈣結節(圖1)。

圖1 MC3T3-E1細胞誘導3、7、14及21天時茜素紅染色結果(×100)A.成骨誘導組；B.對照組

2.堿性磷酸酶染色結果:成骨誘導組MC3T3細胞誘導3天時基本上無陽性，7天時少數散在細胞陽性，14天時陽性細胞較多及表達較高，21天時出現陽性細胞較多，但較14天時陽性率及陽性強度減弱。對照組MC3T3-E1細胞培養過程中無陽性反應(圖2)。

圖2 MC3T3-E1細胞誘導3、7、14及21天時ALP染色結果(×100)A.成骨誘導組；B.對照組

3.MC3T3-E1細胞成骨誘導中細胞real time RT-RCR結果:與未加誘導液組作為對照，MC3T3-E1細胞誘導3、7和14天時，S100A4 和RANKL mRNA表達逐漸減弱，而誘導21天時S100A4 和RANKL mRNA表達比14天時要增加；S100A6 mRNA表達在誘導7和14天時較低，在3和21天時表達逐漸較高；ALP 和RUNX2 mRNA在3、7和14天時表達逐漸增加，之后出現減弱趨勢；OPG mRNA 表達逐漸減弱。S100A4、S100A6、OPG、RANKL、ALP及RUNX2在各時間段比較差異均有統計學意義(P<0.05,圖3)。

圖3 S100A4、S100A6、OPG、RANKL、ALP和RUNX2 mRNA表達結果A.S100A4；B.S100A6；C.OPG；D.RANKL；E.ALP；F.RUNX2

4.TRAP染色結果:RAW264.7細胞在分化5天時，出現典型TRAP染色結果(圖4)。

圖4 RAW264.7細胞分化TRAP染色結果(×100)A.1天；B.3天；C.5天

5.RAW264.7細胞分化中real time RT-RCR結果:與未加誘導液對照，隨著RAW264.7細胞逐漸分化， TRAP mRNA表達逐漸增加，S100A4 mRNA表達逐漸增加，S100A6 mRNA表達逐漸下降。S100A4和TRAP 3天和5天比較，差異有統計學意義(P<0.05)，而S100A6在1天和3天比較，差異有統計學意義(P<0.05，圖5)。

圖5 S100A4、S100A6 和 TRAP mRNA在破骨細胞形成各時間段時表達結果A.S100A4;B.S100A6;C.TRAP

討 論

原發性骨質疏松是骨吸收和骨形成平衡受到破壞，骨吸收明顯增加，是一種全身代謝性疾病，包括絕經后、老年性和特發性等3種，是一種以骨量減少及骨組織結構變化，導致骨脆性增加及骨折風險增加的全身代謝性骨病。隨著生活水平提高，老齡化越來越嚴重，骨質疏松患病率不斷升高而備受人們的重視[8,9]。原發性骨質疏松是由多種基因-環境因素等微小作用積累的共同結果，但具體發病機制尚未完全闡明，主要表現為破骨細胞功能增強或成骨細胞功能減弱，導致骨骼形成減少或骨骼破壞增加而引起骨質疏松。

研究發現S100蛋白可能參與調節骨形成或骨吸收[10]。Yoshida等[11]研究發現S100蛋白可增加可溶性RAGE，從而直接或間接參與sRANKL誘導的破骨細胞生成。Kato等[12]用siRNA抑制牙周韌帶細胞中S100A4蛋白后，發現骨鈣素(osteocalcin)和骨保護素(osteoprotegerin)等成骨相關因子表達減弱，礦物質化受到抑制，推測S100A4蛋白與牙周韌帶細胞成骨分化及礦物質化有關。本研究通過檢測S100A4和S100A6 mRNA在成骨細胞和破骨細胞分化中表達的變化，探討S100A4和S100A6骨形成與骨吸收的關系。

本研究中茜素紅染色和ALP染色結果提示MC3T3-E1細胞成骨誘導分化成功，然后在轉錄水平檢測了S100和成骨相關因子等表達情況。與對照組比較，ALP 和RUNX2 mRNA在誘導3、7和14天時表達逐漸增加，之后出現減弱趨勢。根據本實驗ALP mRNA表達結果和實驗時間點跨度的選擇，考慮誘導10天左右時ALP mRNA表達可能出現最高峰，這樣與理論水平基本一致；RUNX2是一類參與調控成骨的特異性轉錄因子，在成骨細胞分化中早期階段高表達，到晚期出現下降趨勢，與本實驗結果相符合[13,14]。

本實驗發現誘導早期時細胞中OPG mRNA表達均比對照組高，但呈逐漸下降趨勢，晚期表達與對照組比較差異無統計學意義；成骨誘導早期RNAKL表達趨勢與OPG一樣，晚期表達出現升高趨勢；OPG屬于腫瘤壞死因子受體家族成員，在成骨細胞中高表達[15]；理論上OPG在成骨細胞分化中表達逐漸升高，但實際上OPG表達和分泌受到其他基因的正負調控，以及MC3T3-E1細胞分化過程中可能會分泌下調OPG表達的細胞因子或其他成分，從而出現OPG表達變化量在減少；對照組晚期出現鈣結節，提示部分MC3T3細胞已經分化為成骨細胞，導致OPG表達升高，因此在誘導晚期出現誘導組和對照組OPG表達差異無統計學意義；RANKL表達在一定程度上受到OPG及其他成骨相關因子影響，因此本實驗OPG和RANKL結果與實際情況相符合。最后，筆者發現S100A4 mRNA在誘導3、7和14天時表達逐漸減弱，之后出現增加趨勢，但與對照組比較，仍是下降趨勢。S100A6 mRNA在誘導3天和21天較高，在誘導7天和14天較低，無明顯時間依賴性變化。本研究S100A4結果與Duarte等[6]研究發現S100A4蛋白在成骨細胞分化及礦物質吸收過程中起負性調節作用的結果基本相符合。而S100A6蛋白在成骨誘導分化中目前暫無相關文獻報道。因此根據實驗結果，筆者推測S100A4蛋白參與調控成骨誘導分化過程，而S100A6蛋白可能與成骨誘導分化過程中某個時期相關。

本實驗進一步檢測S100A4和S100A6 mRNA在RAW264.7細胞分化過程中表達情況。筆者發現TRAP在RAW264.7細胞誘導破骨細胞過程中表達逐漸增加，具有時間依賴性；TRAP是破骨細胞形成的相關因子，主要由破骨細胞分泌，代表破骨細胞活性，在分化晚期表達最高，因此TRAP結果與實際情況相符合。與未加誘導液比較，S100A4 mRNA在破骨細胞形成過程中表達逐漸升高，在分化晚期差異有統計學意義；S100A6 mRNA 在破骨細胞形成過程中表達逐漸下降，但始終比對照組高，在分化早期差異有統計學意義。Yoshida等[11]研究發現S100蛋白可增加可溶性RAGE，從而直接或間接參與sRANKL誘導的破骨細胞生成。綜合研究結果和相關文獻報道，本研究推測S100A4和S100A6蛋白可能參與調控破骨細胞過程。

綜上所述，S100蛋白可能參與調控絕經后骨質疏松癥的發病機制。本研究從轉錄水平上檢測S100A4和S100A6蛋白在成骨細胞和破骨細胞形成中表達結果，筆者推測S100A4蛋白既參與調控成骨過程，又參與調控破骨過程；而S100A6可能僅參與調控破骨過程，今后將進一步探討S100A4和S100A6蛋白對絕經后骨質疏松的作用機制，以及在臨床上驗證S100A4和S100A6蛋白在骨質疏松標本中表達及意義。