基于超高效液相色譜-高分辨質譜法的油料作物脂質組學分析

趙新楠，王秀嬪*，李培武，印南日，萬立昊，5，王 曉，張良曉

(1.中國農業科學院油料作物研究所，湖北 武漢 430062；2.農業農村部油料作物生物學與遺傳改良重點實驗室，湖北 武漢 430062；3.農業農村部油料作物風險評估重點實驗室，湖北 武漢 430062;4.農業農村部油料及制品質量監督檢驗測試中心，湖北 武漢 430062；5.河南工業大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001)

人體膳食對植物性油脂的攝入主要來自油料作物，其主要成分為脂質。國際脂質分類和命名委員會將脂質分為8類：脂肪酸類(FA)、甘油酯類(GL)、甘油磷脂類(GP)、鞘脂類(SP)、糖脂類(SL)、聚酮化合物(PK)、甾醇類(SP)和異戊烯醇類(PR)[1]。油料作物的主要成分甘油三酯(Triglyceride,TG)是脂肪傳遞介質，也是人體重要的儲能物質[2-3]。除甘油三酯外，油料作物中的其他脂質成分對生命體也有重要意義。例如磷脂具有較高的營養價值，是構成細胞膜的主要成分，對細胞膜結構、功能及信號傳導有重要作用，此外還能夠促進神經傳導，改善記憶力，研究證明癌癥的發生也與磷脂有關[4-6]。磷脂在形成抗血栓、抗動脈粥樣硬化、抗炎以及降低心血管疾病和膽固醇水平等方面發揮著關鍵作用，從食物中攝取的磷脂對人體健康十分重要[7-8]。然而，由于脂質種類眾多，結構復雜，對其準確定性定量仍是目前的科學難題。

目前對于油脂脂質的分析主要集中于植物油，尤其是關于磷脂的研究主要聚焦于毛油和油腳的分析，關于油料作物本身的脂質組成研究較少，在一定程度上影響了油料作物脂質成分的合理應用。張東等[9-10]利用高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜(HPLC-TOF-MS)分析了椰子油及大豆油中的部分甘油三酯成分；Verardo等[11]使用HPLC-TOF-MS分析了初榨橄欖油中的部分甘油磷脂成分；趙琦琰等[12]利用直接進樣高效液相色譜-蒸發光檢測器(HPLC-ELSD)測定了花生中的磷脂成分。上述研究結果僅針對脂質中某類成分進行分析，不能從全局角度完整分析油料中的脂質。

脂質組學是通過表征和定量對脂質分子種類及其生物學功能進行全面描述的新研究方向[13-15]。將脂質組學的方法運用于油料作物全脂質分析，可為油料作物脂質分析提供新途徑。Orbitrap Fusion質譜儀是四極桿、線性離子阱、傅立葉變換離子回旋共振雜合質譜，具有高分辨率、高靈敏度以及高質量精度的特點，可在一次掃描中生成大量質譜信息，在短時間內獲得未知物的多級質譜碎片以及大量脂質信息，從而更好地實現復雜脂質的檢測、分離和鑒定。利用精確分子質量，Orbitrap Fusion 質譜儀可確定出脂質成分的唯一分子式，結合保留時間和二級質譜可實現對脂質結構中脂肪酸鏈的鑒別，從而實現脂質的唯一定性。本研究利用超高效液相色譜-高分辨質譜(UPLC-Orbitrap Fusion MS)技術實現了油菜籽、大豆、花生、向日葵籽、玉米5種油料作物中脂質分子的精準定性，識別出132種脂質分子，并使用峰面積比進行了相對含量的比較。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

甲醇、乙腈、異丙醇(色譜純,賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；氯仿(色譜純,國藥集團化學試劑有限公司)；甲酸(純度>98%)、甲酸銨(純度>99%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

DTC-27J超聲波水浴鍋(湖北鼎泰生化技術設備制造有限公司)；移液槍(德國Eppendorf公司)；XH-C旋渦混勻器(常州未來儀器制造有限公司)；Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司)；Hitachi CT6E離心機(日本日立有限公司)；BF-2000型氮氣吹干儀(北京八方世紀科技有限公司)。

Dionex 高效液相色譜系統串聯Thermo Orbitrap Fusion質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm，美國Waters公司)。脂質分析軟件lipidsearch 4.0(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品提取樣品脂質提取參考Bligh和Folch等的方法[16-17]，準確稱取0.5 g油料(油菜籽、大豆、花生、向日葵籽、玉米)粉末樣品于10 mL具塞離心管中，加入6.0 mL氯仿-甲醇(2∶1，體積比)混合溶液，旋渦混勻；30 ℃超聲波提取30 min后，以3 500 r/min離心10 min，取全部上清液。上清液中加入1.0 mL超純水，旋渦混勻后，3 500 r/min離心10 min，取下層液體用500 μL氮氣吹干，用1.0 mL 氯仿-甲醇(1∶2)混合溶液復溶，過0.22 μm有機相濾膜后保存于進樣瓶中，待超高效液相色譜-高分辨質譜分析。

1.2.2 超高效液相色譜-高分辨質譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；流動相：A為乙腈-水(6∶4，體積比)混合溶液(含0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸銨)，B為異丙醇-乙腈(9∶1，體積比)混合溶液(含0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸銨)。流動相梯度在文獻方法[18]的基礎上，進一步優化縮短分析時間，洗脫梯度如下：0～0.5 min，20% B；0.5～1.5 min，20%～40% B；1.5～3 min，40%～70% B；3～13 min，70%～98% B；13～13.1 min，98%～20% B;13.1～17 min，20% B。流速為0.2 mL/min；進樣量為1 μL；柱溫為40 ℃。

質譜條件：離子源為電噴霧電離源(ESI)，采用Data Dependent MS2掃描模式采集數據。離子源參數如下：噴霧電壓：3 500(+)V/3 000(-)V，毛細管溫度：320 ℃，霧化溫度：320 ℃，輔助氣流速：6.05 L/min，鞘氣流速：8.4 L/min，碰撞氣流速：0 L/min；一級質譜條件：全掃描范圍為150～1 200m/z；Orbitrap分辨率：240 000；自動增益控制(AGC)：1.0e6；最大注入時間：100 ms。二級質譜條件：碎裂方式為高能誘導裂解(HCD);HCD碰撞能量：(35±5) eV；Orbitrap分辨率：30 000；AGC：5.0e4；最大注入時間：60 ms。

1.2.3 定性、定量及統計分析脂質分子的碎片信息如表1所示，在正離子模式下甘油酯通過產生的母離子[M+NH4]+以及二級質譜碎片(脂肪酸相關碎片)與數據庫結合進行定性分析，甘油磷脂和溶血甘油磷脂則通過負離子模式下產生的母離子[M+HCOO]-、[M-H]-以及二級質譜碎片(脂肪酸碎片和特征碎片)與數據庫結合進行定性，同時結合脂質分析軟件lipidsearch 4.0進行分析。利用峰面積進行相對定量，峰面積計算使用軟件Xcalibur(Version 2.0.7;Thermo Fisher Scientific)建立方法，圖表繪制使用Microsoft excel以及MetaboAnalyst完成。

表1 各類脂質在正、負離子模式下的碎片信息Table 1 Fragment informations of lipids in positive and negative ion modes

*R,R1and R2all refer to fatty acid chains(R、R1、R2均指脂肪酸鏈)

2 結果與討論

分別采用正、負離子模式采集數據，發現在“1.2.2”洗脫梯度下，脂質成分約從5 min開始逐漸被洗脫下來，主要集中于5～15 min出峰，部分保留時間相近的峰不易分開，但可通過將譜圖放大后，選擇目標離子的二級質譜進行鑒定,并結合軟件lipidsearch 4.0的識別結果進行篩選，設置母離子和二級離子的質量精確度匹配閾值與提峰質量精確度閾值均為5 ppm。

2.1 油料作物中脂質成分的定性分析

經過分析從5種油料作物中獲得132種主要脂質成分，包括8種甘油二酯(DG)、5種LPC、2種LPE、24種PC、18種PE、8種PI、1種PS、1種PG以及65種TG，所有脂質的母離子和二級碎片離子如表2所示。

表2 脂質成分的母離子及二級碎片離子Table 2 Parent ions and secondary fragment ions of lipids compositions

(續表2)

NumberLipid specieParent ionMS(m/z)MS2(m/z)56PE(18∶2/22∶0)[M-H]-798.599 3279.232 2,339.325 9,140.011 357PE(18∶3/18∶3)[M-H]-734.474 8277.216 6,140.011 458PG(16∶0/18∶2)[M-H]-745.500 2279.232 2,255.232 3,171.005 859PI(16∶0/18∶1)[M-H]-835.531 1281.247 9,255.232 3,241.011 260PI(16∶0/18∶2)[M-H]-833.516 1279.232 3,255.232 4,241.011 361PI(16∶0/18∶3)[M-H]-831.500 7255.232 3,277.216 6,241.011 262PI(18∶0/18∶1)[M-H]-863.562 7283.263 5,281.247 9,241.011 263PI(18∶1/18∶1)[M-H]-861.547 0281.247 8,241.011 164PI(18∶1/18∶2)[M-H]-859.530 9281.247 9,279.232 3,241.011 265PI(18∶2/18∶2)[M-H]-857.515 6279.232 2,241.011 266PI(18∶2/18∶3)[M-H]-855.500 4279.232 1,277.216 6,241.011 267PS(18∶2/22∶0)[M-H]-842.589 1339.325 9,279.232 3,755.559 668TG(14∶0/16∶0/18∶1)[M+NH4]+822.757 1549.489 1,577.520 3,523.473 1,239.237 6,265.235 0,339.290 369TG(15∶0/16∶0/18∶1)[M+NH4]+836.772 9563.504 3,537.489 0,577.520 3,225.221 9,239.273 4,265.252 970TG(15∶0/16∶0/18∶2)[M+NH4]+834.757 6561.488 9,537.488 9,575.504 6,225.221 9,239.273 4,263.237 671TG(15∶0/18∶1/18∶1)[M+NH4]+862.788 9563.504 4,603.535 9,225.221 8,265.253 172TG(15∶0/18∶1/18∶2)[M+NH4]+860.773 3601.520 5,561.489 1,563.504 6,225.221 9,263.237 6,265.253 173TG(15∶0/18∶2/18∶2)[M+NH4]+858.758 1561.488 9,599.504 8,225.221 9,263.237 674TG(15∶1/16∶0/18∶2)[M+NH4]+832.741 9575.504 9,559.473 7,535.473 7,223.206 1,239.273 4,263.237 675TG(15∶1/18∶2/18∶2)[M+NH4]+856.742 2599.504 8,559.473 4,223.206 1,263.237 676TG(16∶0/16∶0/16∶0)[M+NH4]+824.773 7551.504 5,239.237 477TG(16∶0/16∶0/18∶1)[M+NH4]+850.789 4577.520 3,551.504 9,239.237 4,265.253 278TG(16∶0/16∶0/18∶2)[M+NH4]+848.772 9575.504 7,551.504 8,263.237 5,239.237 479TG(16∶0/16∶1/18∶2)[M+NH4]+846.757 3573.489 2,575.504 9,549.485 180TG(16∶0/18∶1/18∶0)[M+NH4]+878.820 5605.551 5,577.520 4,579.535 6,265.253 1,239.237 3,267.268 981TG(16∶0/18∶1/18∶1)[M+NH4]+876.804 3577.520 5,603.536 2,265.253 2,239.237 482TG(16∶0/18∶1/18∶2)[M+NH4]+874.788 9577.520 4,575.504 9,601.520 5,263.237 5,265.253 1,239.237 483TG(16∶0/18∶1/19∶1)[M+NH4]+890.784 0577.520 1,591.498 9,617.526 2,239.237 2,265.253 0,279.232 384TG(16∶0/18∶1/20∶0)[M+NH4]+906.851 8577.520 5,607.567 6,633.583 0,239.237 6,265.235 1,295.299 985TG(16∶0/18∶1/20∶1)[M+NH4]+948.898 6577.520 3,649.614 5,675.630 0,239.273 4,265.253 1,337.347 586TG(16∶0/18∶1/21∶0)[M+NH4]+920.866 9577.520 4,621.583 2,647.598 7,239.237 4,265.253 1,309.315 087TG(16∶0/18∶1/22∶0)[M+NH4]+934.882 9635.598 5,577.520 4,661.614 6,265.253 1,323.332 1,239.237 488TG(16∶0/18∶1/24∶0)[M+NH4]+962.914 4577.519 9,663.630 2,689.646 2,239.237 0,265.253 389TG(16∶0/18∶2/18∶2)[M+NH4]+872.773 5575.504 6,599.504 8,263.237 4,239.237 390TG(16∶0/18∶2/18∶3)[M+NH4]+870.758 2573.489 2,575.504 9,597.489 6,261.221 5,263.237 5,239.237 291TG(16∶0/18∶2/19∶0)[M+NH4]+890.783 8575.504 8,593.515 4,617.575 0,239.237 2,263.237 4,281.247 392TG(16∶0/18∶2/19∶1)[M+NH4]+888.768 9575.504 9,591.499 6,615.499 6,239.237 5,263.237 5,279.232 593TG(16∶1/18∶2/18∶2)[M+NH4]+870.758 2573.489 3,599.505 1,237.221 9,263.237 694TG(16∶2/18∶2/18∶2)[M+NH4]+868.743 2571.473 5,599.504 9,235.206 1,263.237 595TG(17∶0/18∶1/18∶2)[M+NH4]+888.804 3601.520 3,589.520 9,591.536 5,263.236 5,265.254 096TG(17∶1/18∶1/18∶2)[M+NH4]+886.788 3589.520 9,587.504 8,601.520 497TG(17∶1/18∶2/18∶2)[M+NH4]+884.773 9587.504 9,599.504 9,263.237 5,251.237 598TG(17∶2/18∶2/18∶2)[M+NH4]+882.758 2585.489 3,599.505 0,263.237 5,249.221 799TG(18∶0/18∶1/18∶1)[M+NH4]+904.835 6605.551 5,603.536 2,265.253 1,339.289 7100TG(18∶1/18∶1/18∶1)[M+NH4]+902.819 5603.536 3,265.253 2,339.290 0101TG(18∶1/18∶1/18∶2)[M+NH4]+900.804 0601.520 5,603.536 1,265.253 1,263.237 6,339.289 9,337.274 7102TG(18∶1/18∶1/19∶1)[M+NH4]+916.799 3617.515 3,603.536 1,279.236 5,265.253 1103TG(18∶1/18∶1/20∶0)[M+NH4]+932.867 0633.582 2,603.534 1,265.253 0,339.219 9104TG(18∶1/18∶1/20∶1)[M+NH4]+930.851 0631.567 5,603.536 3,265.237 5,293.284 5105TG(18∶1/18∶1/21∶0)[M+NH4]+946.882 3603.536 1,647.598 6,265.253 1,309.316 5106TG(18∶1/18∶1/22∶0)[M+NH4]+960.898 8661.614 6,603.536 1,265.253 1,323.331 1,339.289 9,397.368 3107TG(18∶1/18∶1/23∶0)[M+NH4]+974.913 9675.630 1,603.536 1,265.253 1,337.347 1108TG(18∶1/18∶1/24∶0)[M+NH4]+988.930 5689.646 1,603.536 3,265.253 2,351.362 9109TG(18∶1/18∶2/18∶2)[M+NH4]+898.788 8601.520 3,599.504 9,263.237 5,265.253 1,337.274 2,339.290 0110TG(18∶1/18∶2/20∶0)[M+NH4]+930.851 4631.567 4,633.582 6,601.520 4,263.237 5,265.253 1,295.300 3111TG(18∶1/18∶2/20∶1)[M+NH4]+928.835 0601.520 9,629.552 2,631.567 8,265.253 3,263.237 6,293.284 7112TG(18∶1/18∶2/21∶0)[M+NH4]+944.866 3601.520 6,645.583 4,647.598 8,263.237 5,265.253 1,309.316 5113TG(18∶1/18∶2/22∶0)[M+NH4]+958.882 4659.598 9,661.613 2,601.519 9,265.253 3,263.237 3,323.330 9114TG(18∶1/18∶2/23∶0)[M+NH4]+972.897 8675.630 1,673.614 6,601.520 4,265.253 0,263.375 0,337.274 6115TG(18∶1/18∶2/24∶0)[M+NH4]+986.913 7601.520 6,689.646 2,687.630 4,265.253 1,263.237 5,351.362 9116TG(18∶1/18∶2/24∶1)[M+NH4]+984.898 5687.630 3,601.520 4,685.613 9,263.237 4,265.252 7,349.346 8117TG(18∶1/18∶2/25∶0)[M+NH4]+1 000.929 4903.661 6,701.645 9,601.520 4,265.253 2,263.253 2,365.379 2118TG(18∶2/18∶2/18∶2)[M+NH4]+896.773 2599.504 9,263.237 5,337.274 4

(續表2)

NumberLipid specieParent ionMS(m/z)MS2(m/z)119TG(18∶2/18∶2/19∶1)[M+NH4]+912.768 2599.504 9,615.499 9,279.236 5,263.237 7120TG(18∶2/18∶2/20∶1)[M+NH4]+926.819 6629.551 8,599.504 9,263.237 5,293.284 5121TG(18∶2/18∶2/20∶2)[M+NH4]+924.803 8599.504 6,627.535 4,263.236 6,291.268 0122TG(18∶2/18∶2/21∶0)[M+NH4]+942.851 0645.583 3,599.504 9,263.237 5,309.316 5123TG(18∶2/18∶2/22∶0)[M+NH4]+956.866 8659.599 1,599.504 8,263.237 0,323.332 1,397.328 5,337.274 3124TG(18∶2/18∶2/22∶1)[M+NH4]+954.851 4657.582 8,599.503 8,263.237 5,321.315 7125TG(18∶2/18∶2/23∶0)[M+NH4]+970.882 0673.614 7,599.504 7,263.237 5,337.274 6126TG(18∶2/18∶2/24∶1)[M+NH4]+982.882 6685.614 6,599.505 1,263.237 4,349.347 4127TG(18∶2/18∶2/25∶0)[M+NH4]+998.913 5701.645 7,599.504 7,263.253 2,365.379 2128TG(18∶2/18∶3/18∶2)[M+NH4]+894.757 8597.489 5,599.505 0,263.237 5,261.222 0,337.242 5,335.258 9129TG(18∶2/18∶3/18∶3)[M+NH4]+892.742 3597.489 4,595.473 9,261.221 9,263.237 6130TG(18∶2/18∶3/25∶0)[M+NH4]+996.897 9701.645 6,699.630 1,597.489 0,261.221 7,263.253 2131TG(18∶1/18∶1/19∶0)[M+NH4]+918.814 6619.531 0,603.536 2,265.253 1,281.247 7132TG(18∶2/18∶2/19∶0)[M+NH4]+914.783 7599.504 9,617.515 7,263.237 5,281.248 3

2.2 油料作物中脂質成分的相對定量分析

利用MetaboAnalyst作熱圖比較5種油料作物中定性的132種脂質分子，在相同條件下，同類脂質間的質譜響應具有相似性和可比性，故本實驗利用一級質譜中提取離子色譜峰的峰面積對同類脂質進行相對含量比較[19]。分別比較了甘油酯類(包括65種TG以及8種DG)和磷脂類(包括24種PC、18種PE、8種PI、1種PG、1種PS、5種LPC以及2種LPE)，結果如圖1和圖2所示。

圖1 5種油料作物中甘油酯類脂質的相對含量Fig.1 Relative contents of glyceride lipids in five oil cropsA.rapeseed;B.soybean;C.peanut;D.sunflower seed;E.corn

由圖1可知，不同油料中的甘油酯類脂質含量不同，油菜籽和玉米中各甘油酯類脂質的含量低于大豆、花生和向日葵籽。成分DG(18∶0/18∶1)、DG(18∶1/18∶1)、DG(16∶0/18∶1)、TG(18∶2/18∶2/20∶0)、TG(18∶1/18∶2/20∶0)、TG(16∶0/18∶1/22∶0)、TG(18∶1/18∶1/21∶0)、TG(16∶0/18∶1/19∶1)、TG(16∶0/18∶1/21∶0)、TG(14∶0/16∶0/18∶1)、TG(18∶2/18∶2/20∶1)以及TG(16∶0/16∶1/18∶2)，在花生中含量較高；成分TG(16∶1/18∶2/18∶2)、TG(16∶0/18∶2/18∶3)、TG(15∶1/18∶2/18∶2)、TG(17∶2/18∶2/18∶2)、TG(18∶2/18∶2/22∶1)、TG(18∶2/18∶2/24∶1)、TG(18∶2/18∶2/25∶0)以及TG(18∶2/18∶2/18∶2)，在大豆中含量較高；而成分TG(16∶0/18∶2/19∶0)、TG(18∶1/18∶1/19∶1)、TG(18∶2/18∶2/19∶0)以及TG(18∶1/18∶1/19∶0)，則在向日葵籽中含量較高。

由圖2可知，花生、向日葵籽以及玉米中各磷脂類脂質的含量低于油菜籽和大豆，成分PE(16∶0/16∶0)、PC(16∶0/18∶2)、PC(16∶1/18∶1)、PE(18∶2/22∶0)、PE(16∶0/18∶2)、PC(18∶1/19∶0)、LPC(16∶0)、PC(18∶2/18∶2)、PI(16∶0/18∶2)、PE(16∶0/18∶3)、PE(18∶2/20∶0)以及PC(16∶0/18∶3)，在大豆中含量較高；而成分LPC(18∶1)、PC(18∶1/18∶2)、LPE(18∶1)、PI(18∶1/18∶2)、PE(18∶1/18∶2)、PC(14∶0/18∶1)、PC(16∶0/16∶1)、PC(16∶1/18∶3)、PC(16∶2/18∶2)、PE(15∶0/18∶1)以及PE(16∶0/17∶1)，則在油菜籽中含量較高。脂質成分的含量差異可能是由于不同的油料作物中，其脂肪酸含量有差異，導致合成的脂質含量不同。

圖2 5種油料作物中磷脂類脂質的相對含量Fig.2 Relative contents of phospholipids in five oil cropsA.rapeseed;B.soybean;C.peanut;D.sunflower seed;E.corn

3 結 論

本研究建立了基于超高效液相色譜-高分辨質譜的油料作物中脂質成分分析的方法，對油菜籽、大豆、花生、向日葵籽、玉米5種油料作物中脂質分子進行分析。利用正離子模式下的二級質譜確定甘油酯類脂質的脂肪酸鏈組成，利用負離子模式下的二級質譜確定磷脂類脂質的脂肪酸組成，共定性出132種脂質分子，并用熱圖法對5種油料作物中132種脂質成分的相對含量進行了比較，為更好地實現油料作物中脂質成分的應用提供了研究基礎。