環狀RNA在白血病中的研究進展

李 濤 陳占國 鄭曉群

白血病是一類造血干細胞的惡性克隆性疾病，根據白血病細胞的分化成熟程度和自然病程，將白血病分為急性白血病和慢性白血病兩大類。根據主要受累的細胞系列可將急性白血病分為急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)。慢性白血病則分為慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)、慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphoblastic leukemia，CLL)及少見類型的白血病。近年來，隨著支持治療的加強、多種化療藥物聯合和高劑量化療方案以及造血干細胞移植的臨床應用，白血病患者的生存質量得到很大改善。然而，仍有部分白血病患者，如急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)患者因PML-RARα融合基因、NPM1基因、FLT3-ITD融合基因和CML患者BCR-ABL1融合基因突變出現化療藥物耐藥等原因，疾病發生、進展甚至死亡[1,2]。白血病的臨床診斷、治療方案選擇及預后評估監測等方面的研究已經進入分子生物學階段；白血病細胞的增殖、分化和凋亡機制也正逐漸為人們所認識。某些特定非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)可作為關鍵分子參與白血病的發病機制，其表達異常可用于白血病的亞型分類、預后評估及藥物治療反應的預測。目前，已有大量研究報道ncRNA在白血病的臨床診斷、治療方案選擇、預后評估、發病機制及耐藥機制等方面中的重要作用[3, 4]。circRNA是一類與多種疾病，特別是與癌癥相關的新型ncRNA。研究證實，circRNA主要作為miRNA的分子海綿參與白血病的發病機制，并在白血病細胞的增殖、分化、凋亡及化療藥物耐藥等方面中的作用正逐漸被人們所認識[5]。本文通過對circRNA在白血病中的研究進展進行綜述，有助于提高人們對circRNA在白血病中作用的認識。

一、circRNA在AML中的作用

AML具有高度異質性、疾病進展快、復發率高和長期生存率較低等特征，其發生率隨年齡的增長而增加，它也是成人最常見的急性髓系原始細胞惡性腫瘤。目前認為AML的發病和對化療藥物的耐藥是多個基因突變及多種機制參與的結果，AML的預后也隨疾病的不同危險分層而有明顯的差異[6]。有研究報道證實circRNA在AML中具有重要的作用，其表達上調或下調可能是由于白血病細胞的異常受損所致的，這些表達異常的circRNA可能參與了AML的發病和對化療藥物的耐藥機制。體外和體內實驗已經證實，融合circRNA起源于染色體易位產生的融合基因。Guarnerio等[7]證實PML-RARα衍生的f-circPR和MLL-AF9衍生的f-circM9均能促進AML疾病的惡性轉化、化療藥物的耐藥和白血病細胞的存活。不難發現，circRNA在AML細胞的生命歷程、化療藥物耐藥及發病機制的作用因其表達上調或下調而大相徑庭。

1.circRNA表達下調在AML中的作用：circRNA表達下調的檢測在AML細胞分化的判斷、疾病的診斷和預后評估等方面具有很好的應用前景。有研究者揭示了AML患者的circRNA表達譜，鑒定到大量可能在AML中特異表達的circRNA，其中最有意義的hsa_circ_0004277可作為AML的新型生物學標志物，其下調預示著AML治療的良好預后[8]。然而在circRNA-miRNA相互作用網絡以及是否與化療藥物耐藥相關等方面，他們并沒有做詳細的研究。另外，Li等[9]對APL相關circRNA的構型和功能及在全反式維甲酸(all-trans-retinoicacid，ATRA)治療過程中的動態調節進行了研究，該研究在circRNA的構型及功能分析中證實，APL細胞中表達的circRNAs大多是外顯子衍生的，不是剪接過程中的副產物，它們獨立于宿主線性miRNAs進行調控，可用于區分造血干細胞、中性粒細胞和淋巴細胞[9]。該研究還在NB4細胞株和初發APL患者樣本中，證實了circRNA存在差異表達且穩定性好，其中circ-HIPK2位于細胞質，可作為分化相關miR-124-3p的分子海綿，影響ATRA誘導的APL細胞分化。總之，該研究揭示了circRNA在APL疾病發展和治療中的生物學功能，circ-HIPK2在正常外周血單個核細胞和其他AML亞型中的表達明顯下調，表明了它可作為APL潛在的生物學標志物，同時這為circRNA在APL中的后續研究提供了參考價值。

2.circRNA表達上調在AML中的作用：circRNA的表達上調與其表達下調相比在AML預后評估和化療藥物耐藥機制等方面的研究有明顯優勢。nucleophosmin(NPM1)被認為是在AML患者中最容易發生基因突變的基因，該基因突變往往提示疾病的不良預后。Hirsch等[10]通過轉錄組測序技術分析了AML野生型NPM1和AML突變型NPM1患者的circRNA突變數。該研究發現circNPM1 75001在AML患者中呈高度表達。雖然circNPM1 75001與NPM1突變狀態無關，但其表達與總NPM1表達呈正相關。另外，AML患者往往發生髓外浸潤情況，通常預示著不良預后。Lv等[11]比較髓外浸潤組與非髓外浸潤組的骨髓circRNA表達譜，與非髓外浸潤組AML樣本比較，髓外浸潤組有253個circRNA和663個靶基因上調，259個circRNA和838個靶基因下調，其中17個circRNA的7個靶基因(LRRK1、PLXNB2、OLFML2A、LYPD5、APOL3、ZNF511和ASB2)與AML患者的不良預后相關。2018年，有研究者探討了circDLEU2、miR-496和PRKACB基因在AML中的作用機制，該研究證實circDLEU2在AML患者骨髓和AML細胞中表達上調，其表達上調可促進AML細胞增殖，抑制AML細胞凋亡，進而促進腫瘤的形成。功能實驗表明，circDLEU2通過抑制miR-496而促進PRKACB基因表達，進而加速AML的疾病發展。另外，circRNA也在介導AML化療藥物耐藥機制中發揮了重要的作用。Shang等[12]建立耐多柔比星的THP-1/ADM細胞系，并利用高通量測序技術得到THP-1/ADM細胞系和原生代THP-1細胞的circRNA表達譜。該研究證實circPAN3是AML細胞耐藥的關鍵分子，并通過circPAN3/miR-153-5p/XIAP軸發揮作用，因此該研究揭示了circPAN3可作為預測AML化療療效的指標，也為逆轉AML化療藥物耐藥提供了潛在作用靶點。另據報道，circ-PVT1被認為是作為腫瘤抑制miRNAs(如let-7或miR-125家族)的分子海綿，它在異常核型的AML患者中的表達水平明顯高于正常核型的患者，其異常表達預示AML往往發生進展[13,14]。

在AML細胞的增殖、分化、凋亡及發病機制方面，研究證實hsa_circ_100290在AML患者及細胞系中表達增加，其表達下調或沉默可顯著抑制AML細胞的增殖，并誘導AML細胞凋亡；circRNA-miRNA相互作用網絡分析表明，miR-203靶向調節hsa_circ_100290和rab_10的表達，miR-203抑制劑可以逆轉hsa_circ_100290對AML細胞增殖和凋亡的作用[15]。因此，hsa_circ_100290通過靶向作用miR-100290/Rab10軸，在AML細胞增殖和凋亡中起重要的調節作用。另外，Chen等[16]利用高通量測序技術分析了5個AML初診患者骨髓樣本和5個缺鐵性貧血患者骨髓樣本的circRNA表達譜，發現了circ-ANAPC7在AML中表達上調，驗證circ-ANAPC7作為miR-181家族的分子海綿參與AML的發病機制，因此circ-ANAPC7可能可作為AML診斷的新型生物學標志物。另據報道，circ_0009910表達上調提示AML患者的不良預后，沉默circ_0009910的表達，可靶向作用 miR-20a-5p而抑制AML細胞增殖，從而導致AML細胞凋亡，因此circ_0009910可作為AML潛在的治療靶標[17]。簡而言之，無論circRNA在AML中表達上調或下調，它在AML細胞的生命歷程、發病機制、預后評估和化療藥物耐藥機制中發揮著重要的作用。

二、circRNA在CML中的作用

CML是一種發生在多能造血干細胞的惡性骨髓增殖性腫瘤，主要涉及髓系，外周血粒細胞顯著增多并伴不成熟性，其典型遺傳特征是t(9；22)(q34；q11)相互易位，該易位導致BCR-ABL1融合基因形成，從而導致酪氨酸激酶的活化。circRNA的表達上調或下調在CML的預后評估、發病機制和對化療藥物的耐藥中發揮著重要的作用。研究表明，高表達circ_100053預示CML預后不良，并與伊馬替尼耐藥有關。亦有文獻報道circBA9.3是一種與酪氨酸激酶活性增加相關的分子，它可促進CML細胞對酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKI)的耐藥，因此該circRNA可能可作為一個用于預測CML患者TKI耐藥的潛在靶標[18]。2018年，Liu等[19]向人們展示了CML患者circRNA的表達譜及鑒定出大量差異表達的circRNAs，并構建了CML中潛在的circRNA-miRNA相互作用網絡，其中包括一個hsa_circ_0080145介導的ceRNA調控網絡。該研究最后證實hsa_circ_0080145通過充當miR-29b分子海綿的作用而抑制CML細胞的增殖。但是，CML疾病進展相關和TKI耐藥相關的circRNA整體的動態調節網絡及其作用機制仍有待于進一步研究闡明。

三、circRNA在ALL中的作用

ALL是兒童常見的惡性腫瘤，絕大多數是由于相關基因突變導致淋巴干祖細胞惡性增殖，并伴有不同程度的發育分化受阻而導致的遺傳異質性腫瘤。研究表明，circRNAs可能參與ALL發病機制，并具有潛在的診斷和治療價值。Dahl等[20]通過高通量RNA 測序分析了 B細胞惡性腫瘤中circRNA表達譜，并采用NanoString數字化基因檢測技術對多個差異circRNA進行定量，該研究提出了一種無需酶促和擴增的數字計數circRNA定量檢測方法，該方法有可能成為circRNA定量檢測的新金標準。

ALL中表達上調的cricRNA在ALL細胞的生命歷程中發揮著重要作用。2018年，Hu等[21]采用實時定量PCR和蛋白印跡法證實，與正常骨髓對照組比較，circPVT1在所有ALL細胞系中的表達顯著上調，敲除該circRNA的功能實驗表明，circPVT1通過抑制其相鄰c-Myc基因和Bcl-2抗凋亡蛋白表達來抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡。亦有研究報道，與正常白細胞比較，ALL和B細胞分化相關的基因(JAK2、PAX5、IKZF1、ETV6和EBF1)產生的circRNA在超二倍體白血病中普遍存在。不難發現與前人研究認為circRNA是多種細胞過程的調節因子，其中包括增殖、分化、信號轉導和衰老等的觀點一致[22]。盡管ALL相關circRNA的研究還處于萌芽階段，隨著基因表達譜、全基因組測序等高通量檢測技術在ALL中的應用，circRNA在ALL中的作用逐步為人們所了解。

四、circRNA在CLL中的作用

CLL是B細胞慢性淋巴增殖性疾病，以單克隆、成熟的CD5+B淋巴細胞在外周血、骨髓、脾臟和淋巴結等淋巴組織進行性累積為特征，是西方國家最常見的成人白血病類型。CLL的年發生率為(2～6)/10萬，隨著年齡的增加，65歲以上患病率高達12.8/10萬。我國 CLL發生率雖低于西方國家但呈現出上升趨勢，且具有發病年齡低、侵襲度高等特點[23]。由于CLL發病具有一定的潛伏期和高度的異質性，CLL的相關circRNA分子機制仍在研究中。

Xia等[24]研究發現，與正常健康人群比較，circ-CBFB在CLL細胞中明顯表達上調，并可作為CLL患者診斷和預后判斷的生物學標志物。由于circRNA有miRNA結合位點，可結合特定的miRNA，調節miRNAs和mRNAs的結合，發揮了競爭性內源 RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)的功能[25]。該研究進一步證實，circ-CBFB通過調節miR-607/FZD3/Wnt/β-catenin軸促進CLL細胞的增殖及抑制其凋亡。另外，Wu等[26]研究發現，與正常對照比較，CLL患者外周血單個核細胞中hsa_cic_0132266的表達量呈明顯下降趨勢，該circRNA作為hsa-miR-337-3p的ceRNA調節其活性，并導致hsa-miR-337-3p的PML下游靶基因的表達改變，進而影響CLL細胞的活力。因此，circ_0132266通過circ_0132266/miR-337-3p/PML軸影響CLL的進展，這表明它可能作為CLL的生物學標志物和潛在的治療靶點。總之，在CLL中circRNA的異常表達影響CLL細胞的生命歷程，這為該疾病的診斷和預后評估提供了新型的生物學標志物。然而，circRNA在CLL整體表達譜及在疾病演化中的動態調節等方面的作用尚未見詳細的文獻報道。

五、展 望

綜上所述，白血病是一類有著復雜遺傳背景的血液系統惡性腫瘤。盡管不斷有新的發病機制及新的治療方案被發現，對于白血病的認識還有待于不斷加深。circRNA在數量上具有高度豐富，在進化上具有物種間保守性，并且它具有組織特異性或細胞特異性表達的特征。更重要的是，circRNA可以在外周血液中大量檢測到，顯示了circRNA作為有潛力的無創癌癥生物學標志物。這些使得它在參與白血病的疾病診斷、預后評估、發病、化療藥物耐藥機制及白血病細胞的增殖、分化、凋亡中發揮著重要作用(表1)。因此，期待circRNA應用到白血病臨床治療工作中，在臨床醫生根據白血病患者臨床特征、骨髓細胞形態學、細胞遺傳學、免疫表型和分子生物學異常等方面對白血病做出危險層級評估后，為患者提供最佳的治療或長期隨訪方案。

表1 circRNA在不同白血病中的作用

circRNA在不同白血病表達上調/下調的作用，潛在相關的靶向miRNA及其宿主基因