miR-497-5p-ENAH對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲運(yùn)動(dòng)的影響

慕剛剛 朱益潔 于紅剛 李紅艷

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在我國(guó)是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生率和病死率呈上升趨勢(shì)，肝癌早期發(fā)現(xiàn)困難，目前5年生存率只有10.1%[1，2]。對(duì)于肝癌發(fā)生的機(jī)制研究、靶向治療分子的研究仍是目前研究的重點(diǎn)。

ENAH(enabled homolog)是Ena/VASP蛋白家族一員，Ena/VASP在調(diào)控細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的形態(tài)改變、細(xì)胞黏附等發(fā)面發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。ENAH調(diào)控于肌動(dòng)蛋白，參與癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞間黏附、極化發(fā)生。之前研究發(fā)現(xiàn)ENAH在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，包括結(jié)直腸癌、宮頸癌、胃癌及胰腺癌等,而且ENAH與腫瘤高侵襲性、惡性預(yù)后明顯相關(guān)[4～6]。ENAH是多個(gè)腫瘤信號(hào)通路的關(guān)鍵靶基因，例如Wnt/β-Catenin信號(hào)通路軸、PPARγ信號(hào)軸[7]。Enah可以分化為不同亞基蛋白，例如在原發(fā)腫瘤中高表達(dá)而在轉(zhuǎn)移癌缺乏的亞基，具有侵襲性的亞基蛋白(Mena++、MenaINV)[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中ENAH呈現(xiàn)高表達(dá)，ENAH與肝癌患者預(yù)后有顯著相關(guān)性，其上游has-miR-497-5p可下調(diào)肝癌細(xì)胞ENAH的表達(dá)，并且通過下調(diào)ENAH來抑制paxillin介導(dǎo)的細(xì)胞極化、黏著斑成熟及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象：收集2018年1月～2019年6月于筆者醫(yī)院肝癌切除標(biāo)本(癌及癌旁組織)，本研究通過武漢大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2.細(xì)胞及試劑：人肝癌細(xì)胞HepG2購自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，HepG2培養(yǎng)用DMEM(10% FBS，5%雙抗)，37℃孵育箱傳代培養(yǎng)。試驗(yàn)用試劑包括抗體有ENAH、GAPDH購自美國(guó)Santa Cruz公司，paxillin及磷酸化paxillin -tyr 31抗體購自美國(guó)Invitrogen公司，羊抗兔IgG(H+L)、F(ab′)2 Fragment(Alexa Fluor?555 Conjugate)、Acti-stainTM488 Fluorescent Phalloidin購自美國(guó)CST公司；miRNA Taqman 探針、Taqman miRNA Multiplex RT Assays 試劑盒均購自美國(guó)Applied Biosystems公司。

3.Oncomine數(shù)據(jù)庫：Oncomine是開放的癌癥基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)。本研究設(shè)置條件為Analysis Type: Liver cancer vs. Normal Analysis；Data Type: mRNA；over-expression，Gene: ENAH。通過在線分析ENAH在不同腫瘤中及肝癌中的表達(dá)差異。

4.The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫：該數(shù)據(jù)庫也稱人類蛋白表達(dá)圖譜，是研究蛋白在人體正常組織、癌組織和癌細(xì)胞系中免疫組化染色狀態(tài)，可進(jìn)行腫瘤組織蛋白差異表達(dá)分析，并且可進(jìn)行基因與腫瘤的生存分析。本研究中，對(duì)ENAH蛋白在人肝癌組織中免疫組化分析，ENAH與肝癌患者預(yù)后進(jìn)行生存分析。

5.組織蛋白提取及免疫印跡：肝癌、癌旁組織標(biāo)本經(jīng)剪碎、研磨，裂解液充分裂解，提取總蛋白，并經(jīng)過BCA法測(cè)定蛋白濃度。免疫印跡過程：取20μg蛋白加入SDS-PAGE上樣孔，并電泳分離后電轉(zhuǎn)移至NC膜，采用10% BSA溶液封閉后用一抗4℃孵育過夜，TBST清洗后加入HRP標(biāo)記的二抗孵育4～6h(4℃)，經(jīng)ECL法顯色后X線膠片曝光并采集圖片。

6.組織RNA提取及測(cè)定:術(shù)后30min內(nèi)通過液氮罐收集新鮮的臨床肝癌、癌旁組織，-80℃冰箱較長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?。參照Trizol RNA提取試劑盒提取組織總RNA，DEPC水溶解，測(cè)定RNA純度和濃度，并取1μl RNA經(jīng)凝膠電泳測(cè)定完整性，進(jìn)行后續(xù)RT-PCR。

7.RT-PCR反應(yīng): 依據(jù)相關(guān)試劑盒操作說明書的步驟操作，應(yīng)用Primer premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)hsa-miR-497-5p 的上游引物、下游引物、反轉(zhuǎn)錄引物序列，本研究采用U6為內(nèi)參。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：RNA 2μl，引物 1μl，dNTP mix 1μl, U6反轉(zhuǎn)錄引物1μl，反轉(zhuǎn)錄酶1μl，RNA酶抑制劑0.5μl，無酶水 9.5μl，設(shè)定條件：16℃ 15min，16℃ 15min，42℃ 60min，85℃ 5min，4℃ 5min。qT-PCR采用SYBR法測(cè)定miR-6838-5p的Ct值，U6為內(nèi)參照，反應(yīng)體系為：混合物(25μl): 引物 2μl，ddH2O 8.5μl，SYBR 12.5μl，cDNA 2μl，條件：95℃ 30s，1個(gè)循環(huán)，95℃ 5s，60℃ 30s，40個(gè)循環(huán)。

8.免疫熒光：將(2～3)×104個(gè)/毫升 miR-497-5p mimic轉(zhuǎn)染后的HepG2單細(xì)胞懸液接種在蓋玻片上，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)至單層。細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)，PBS洗滌3次，4%甲醛固定15min，0.3% Triton-X 100/PBS透膜15min，5% BSA/PBS+血清封閉1h。加入1∶100稀釋的兔抗paxillin一抗溶液，4℃孵育過夜；，再用1∶1000羊抗兔IgG(H+L)，F(xiàn)(ab′)2 Fragment熒光二抗及1∶200的Acti-stainTM488 Fluorescent Phalloidin抗體孵育1h，DAPI染核，置于Olympus 正置熒光顯微鏡下觀察。

9.免疫組化染色及評(píng)分:手術(shù)切除新鮮肝癌及癌旁組織，經(jīng)10%多聚甲醛固定48h后，常規(guī)制作石蠟切片，常規(guī)HE，首先進(jìn)行抗原修復(fù)，修復(fù)溫度99℃、修復(fù)時(shí)間30min，然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(ENAH抗體購自美國(guó)Santa Cruz公司)。評(píng)分：組織切片免疫組織化學(xué)評(píng)分=染色強(qiáng)度分×陽性細(xì)胞著色比例分，結(jié)果分為陰性：不著色，弱著色，著色細(xì)胞<25%；陽性：中等著色，著色細(xì)胞25%～50%；強(qiáng)陽性：強(qiáng)著色，著色細(xì)胞>50%。

結(jié) 果

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中ENAH蛋白在所有腫瘤中的差異表達(dá)分析

1.Oncomine數(shù)據(jù)庫分析ENAH在人體各腫瘤中的差異表達(dá)：Oncomine數(shù)據(jù)庫中設(shè)定搜索條件“gene：ENAH，P-VALUE：1×10-4；FOLD CHANGE：2；GENE RANK：Top 10%；DATA TYPE：all”，ENAH蛋白在大多數(shù)腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)，僅在部分膀胱癌、肺癌、卵巢癌中呈現(xiàn)低表達(dá)，這表明ENAH的表達(dá)存在不同腫瘤間差異性。本研究關(guān)注的肝癌組織中，ENAH在6個(gè)肝癌數(shù)據(jù)集均呈現(xiàn)明顯高表達(dá)(圖1)。

2.Meta分析ENAH在肝癌中差異表達(dá)：通過Oncomine在線分析，設(shè)定篩選條件“Gene：ENAH，Analysis Type: Cancer vs Normal Analysis；Cancer Type: Liver Cancer；Data Type: mRNA；P-VALUE：1×10-4；FOLD CHANGE：2；GENE RANK：Top 10%”。共有5個(gè)數(shù)據(jù)庫滿足篩選：Chen liver(cancer：105例，normal=75，P=2.26×10-25)，Roessler liver(cancer：22例，normal=21，P=3.06×10-12)，Mas liver(cancer：38例，normal=19，P=6.27×10-8)，Roessler liver 2(cancer：225例，normal=220，P=2.67×10-81)，Wurmbach liver(cancer：35例，normal=10，P=6.23×10-8)[9～12]。通過Meta分析證實(shí)ENAH在上述5個(gè)數(shù)據(jù)庫中呈過表達(dá)趨勢(shì)，ENAH mRNA顯著高于對(duì)照組，P=3.11×10-8，Median Rank 146.5(圖2)。

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析ENAH在肝癌中的表達(dá)差異

3.ENAH在肝癌組織中病理表達(dá)：Human Protein Altas數(shù)據(jù)庫，通過免疫組化在線分析ENAH蛋白在肝細(xì)胞癌、膽管細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及胞內(nèi)定位。采用ENAH抗體(No.HPA028696)，免疫組化提示大部分肝細(xì)胞癌、膽管細(xì)胞癌組織中ENAH表達(dá)呈現(xiàn)中、高等強(qiáng)度(肝癌組織 vs 癌旁肝組織：強(qiáng)陽性11 vs 0，陽性23 vs 8，陰性5 vs 29，P<0.05)。IHC提示ENAH蛋白在肝癌細(xì)胞內(nèi)主要分布在胞質(zhì)、胞膜，這與ENAH主要調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)的肌紅蛋白有關(guān)(圖3、表1)。

圖3 ENAH在肝癌組織中的IHC分析A、D.正常肝組織；B、E.膽管細(xì)胞癌；C、F.肝細(xì)胞癌；A～C.放大倍數(shù)為40倍；D～F.放大倍數(shù)為100倍

表1 通過免疫組化染色分析ENAH在肝癌組織中表達(dá)差異

4.肝癌的ENAH生存分析：收集新鮮肝癌組織、癌旁組織，裂解提取總蛋白，通過Western blot法試驗(yàn)同樣證實(shí)ENAH蛋白在肝細(xì)胞癌、膽管細(xì)胞癌中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)， 顯著高于癌旁的正常肝組織(圖4A)。同樣，與正常肝細(xì)胞L-O2比較，其他不同肝癌細(xì)胞中ENAH均呈現(xiàn)明顯的過表達(dá)。通過分析TCCG數(shù)據(jù)庫的已有數(shù)據(jù)，對(duì)ENAH進(jìn)行生存分析，ENAH低表達(dá)患者的預(yù)后佳(P<0.05)。

圖4 ENAH在肝癌組織中表達(dá)及生存分析A.肝癌及癌旁組織中的ENAH蛋白表達(dá)；B.肝癌細(xì)胞系中ENAH蛋白表達(dá)差異；C.ENAH蛋白表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的生存分析。N.正常肝組織；T.肝癌組織，*P<0.05

5.has-miR-497-5p抑制ENAH表達(dá)及paxillin介導(dǎo)的細(xì)胞極化、黏著斑形成：通過軟件Targetscan預(yù)測(cè)ENAH的調(diào)控microRNA為miR-497-5p，ENAH的3′UTR第198-204堿基位點(diǎn)與miR-497-5p結(jié)合。在肝癌組織中，提取總RNA后通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)肝癌中miR-497-5p水平明顯低于癌旁肝組織。在肝癌細(xì)胞HepG2中，通過miR-497-5p inhibitor和miR-497-5p mimic分別抑制、增強(qiáng)細(xì)胞的miR-497-5p的表達(dá)，miR-497-5p mimic誘發(fā)的miR-497-5p高表達(dá)，間接抑制細(xì)胞間黏著斑結(jié)構(gòu)蛋白paxillin的31位點(diǎn)酪氨酸磷酸化(圖5)。

圖5 has-miR-497-5p抑制ENAH表達(dá)及paxillin介導(dǎo)的細(xì)胞極化、黏著斑形成(綠色熒光，×400)A.miR-497-5p與ENAH結(jié)合位點(diǎn)；B.肝癌組織與正常肝組織的miR-497-5p水平比較；C.miR-497-5p抑制HepG2細(xì)胞ENAH蛋白表達(dá)、paxillin酪氨酸磷酸化；D.miR-497-5p抑制paxillin介導(dǎo)的HepG2細(xì)胞骨架微結(jié)構(gòu)極化、細(xì)胞黏著斑形成及成熟

為進(jìn)一步觀察miR-497-5p對(duì)細(xì)胞骨架微結(jié)構(gòu)、黏著斑形成及成熟的影響，將HepG2細(xì)胞進(jìn)行鋪片培養(yǎng)，miR-497-5p mimic轉(zhuǎn)染干預(yù)細(xì)胞miR-497-5p的表達(dá)，免疫熒光觀察細(xì)胞骨架微結(jié)構(gòu)改變(F-actin為標(biāo)志蛋白)、細(xì)胞間黏著斑形成及成熟(paxillin為標(biāo)志蛋白)的變化。miR-497-5p mimic抑制miR-497-5p，細(xì)胞的paxillin磷酸化受抑制，細(xì)胞間黏著斑形成及成熟受限，黏著斑以小為主，散布在胞質(zhì)、胞膜，與之對(duì)應(yīng)的細(xì)胞骨架微結(jié)構(gòu)較紊亂，無明顯方向性及集束、聚集發(fā)生。而對(duì)照組的HepG2細(xì)胞中，F(xiàn)-actin標(biāo)志的細(xì)胞骨架微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯聚集、極化，并向較大的成熟黏著斑聚集、附著，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力明顯高于miR-497-5p mimic干預(yù)組。

討 論

ENAH系Ena/VASP蛋白復(fù)合物(enabled/vasodilator stimulated phosphoprotein)家族成員，ENAH結(jié)合EVL、VASP蛋白形成肌動(dòng)蛋白調(diào)控單位，定位于細(xì)胞引導(dǎo)端、黏著斑及偽足，而且通過偶聯(lián)Integrin α5亞基的胞質(zhì)C末端，促進(jìn)細(xì)胞侵襲、運(yùn)動(dòng)[13]。在多種腫瘤的研究中，已經(jīng)證實(shí)ENAH呈明顯過表達(dá)趨勢(shì)，包括肝細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)直腸癌、唾液腺癌、胰腺癌、乳腺癌[14～19]。HU的肝癌研究表明，肝癌細(xì)胞中ENAH過表達(dá)與腫瘤的分化、進(jìn)展、預(yù)后密切相關(guān)，本研究中也證實(shí)ENAH在肝癌細(xì)胞、膽管細(xì)胞癌中明顯高表達(dá)，而且高表達(dá)ENAH提示腫瘤侵襲力增強(qiáng)和更差的預(yù)后，前期發(fā)現(xiàn)ENAH過表達(dá)促進(jìn)腫瘤EMT、肝纖維化的進(jìn)展。本研究生存分析也證實(shí)，高表達(dá)ENAH肝癌患者預(yù)后更差，后期研究可以探索ENAH作為肝癌預(yù)后的生物學(xué)預(yù)測(cè)標(biāo)志物。

前期研究指出ENAH主要影響細(xì)胞肌動(dòng)蛋白極化、促進(jìn)細(xì)胞突出或偽足形成、EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的黏附和運(yùn)動(dòng)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過miR-497-5p抑制肝癌細(xì)胞內(nèi)ENAH的表達(dá)，間接抑制了HepG2細(xì)胞的細(xì)胞骨架微結(jié)構(gòu)中肌動(dòng)蛋白的極化、細(xì)胞間黏著斑的成熟及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。一項(xiàng)ENAH在胃癌的研究表明，ENAH通過激活MAPK(Erk1/2)、AKT信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)，同樣ENAH也可促進(jìn)癌細(xì)胞上皮細(xì)胞間葉樣轉(zhuǎn)變(EMT)，ENAH被敲低表達(dá)后，癌細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白發(fā)生改變：E-cadherin蛋白下調(diào)，Vimentin和Fibronectin表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞EMT化受到明顯抑制。癌細(xì)胞的EMT經(jīng)典調(diào)控信號(hào)通路包括TGF-β、Wnt/β-catenin和Notch信號(hào)通路軸，而敲低ENAH可以有效抑制上述信號(hào)通路的激活，并且在結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌細(xì)胞中都得到不同程度的驗(yàn)證[20，21]。

microRNAs(miRNAs)是一類小分子非編碼RNAs，主要抑制基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，參與細(xì)胞分裂、血管生成、代謝的生物學(xué)調(diào)控，而且調(diào)控腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展[22]。miR-497-5p位于染色體17p13.1的位置，系miR-15/16/195/424/497簇的一員，該microRNA簇家族5′端包含AGCAGC序列，在細(xì)胞中高度保守。miR-497 目前進(jìn)行了多種腫瘤的觀察研究，在血管肉瘤、子宮內(nèi)膜癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌中已證實(shí)miR-497發(fā)揮抑癌基因的作用，例如miR-497通過Bcl-2誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，在卵巢癌中miR-497抑制PXN2蛋白表達(dá)，抑制腫瘤侵襲，通過調(diào)控Raf-1HE CCND1的蛋白表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲運(yùn)動(dòng)。本研究中肝癌組織中miR-497-5p水平顯著低于正常肝組織，miR-497-5p能夠抑制ENAH的表達(dá)，最終抑制肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞極化、黏著斑形成及成熟，抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲。

生物信息學(xué)是一門新興學(xué)科，它整合了生物學(xué)、數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)不同學(xué)科的優(yōu)勢(shì)，對(duì)腫瘤大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行整合挖掘，數(shù)據(jù)包括高通量基因、蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)等。分析腫瘤中基因、蛋白、轉(zhuǎn)錄、甲基化等生物調(diào)控微小單元的變化，并預(yù)測(cè)腫瘤表達(dá)的差異基因等，從而找出腫瘤治療的新靶點(diǎn)。本研究中涉及的Oncomine、Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫包括了世界上最大的TCGA、病理數(shù)據(jù)庫，包含了目前為止最大的肝癌臨床樣本量，所有數(shù)據(jù)來源于基因芯片，研究方法一致，因此結(jié)論具有極高的可信度。本研究通過生物信息學(xué)計(jì)算，篩選出肝癌與正常肝組織的差異表達(dá)基因ENAH，并對(duì)其病理表達(dá)、預(yù)后生存分析，驗(yàn)證了其調(diào)控microRNA has-miR-497-5p抑制ENAH表達(dá)，并間接抑制肝癌細(xì)胞的細(xì)胞骨架微結(jié)構(gòu)極化、細(xì)胞間黏著斑的形成及成熟，最終抑制肝癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲。