一種細(xì)胞內(nèi)快速標(biāo)記鄰近蛋白復(fù)合物的新方法

劉 健 周 姍 戴大鵬 蔡劍平

生物體功能的實(shí)現(xiàn)需要蛋白質(zhì)的參與，其中多數(shù)生物學(xué)功能的行使必須借助于多種蛋白質(zhì)間相互配合，組成蛋白質(zhì)復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)。研究蛋白質(zhì)間的相互作用及定位組成可以更好地理解相關(guān)蛋白質(zhì)的功能和細(xì)胞內(nèi)外復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。近年來，鄰近蛋白質(zhì)標(biāo)記方法(protein-proximity labeling)被越來越廣泛地應(yīng)用于解析細(xì)胞內(nèi)蛋白復(fù)合物的組成[1, 2]。該方法通過應(yīng)用一種可以混雜標(biāo)記的酶與目的蛋白融合表達(dá)，再添加特定底物，比如生物素，進(jìn)而使得該酶可以在體內(nèi)(in vivo)共價(jià)催化納米級(jí)別范圍內(nèi)的相關(guān)內(nèi)源性蛋白。已有的鄰近標(biāo)記方法主要分為兩大類：一類是以生物素連接酶為基礎(chǔ)，如BioID、BioID2、BASU等[3]；另一類以過氧化物酶為基礎(chǔ)，如APEX 和APEX2。BioID和 APEX2是目前應(yīng)用最為廣泛的鄰近蛋白質(zhì)標(biāo)記方法，二者各自有其獨(dú)特的優(yōu)勢。BioID標(biāo)記方法雖然簡單且無毒，只需加入生物素來起始標(biāo)記過程，但其生物素標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間較長，需要18～24h，無法捕捉瞬時(shí)或作用力較弱的蛋白復(fù)合物。與之相反，APEX2反應(yīng)速度較BioID迅速，適用范圍廣，但其標(biāo)記過程需要對(duì)樣品進(jìn)行H2O2處理，導(dǎo)致有些樣品因其毒性作用而無法適用，同時(shí)氧化處理也可能會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境，從而破壞某些蛋白與蛋白間的相互作用。

為彌補(bǔ)現(xiàn)有鄰近蛋白標(biāo)記方法的不足，2018年Alice YTing領(lǐng)導(dǎo)的科研小組通過對(duì)BirA*進(jìn)行酵母展示技術(shù)定向突變，獲得了一種生物素標(biāo)記時(shí)間顯著降低的生物素連接酶——TurboID, 該酶在相同條件下僅需用生物素處理短短10min即可獲得與傳統(tǒng)BioID類似甚至更高的標(biāo)記效率，徹底解決了限制BioID系統(tǒng)應(yīng)用的最主要技術(shù)瓶頸[4]。本研究率先在國內(nèi)重建了TurboID系統(tǒng)，并將其置于Tet-on系統(tǒng)的調(diào)控之下，以精確調(diào)控目的蛋白的表達(dá)量，隨后將所有表達(dá)單元插入改造后的慢病毒載體，借以大大拓展該系統(tǒng)的細(xì)胞適用范圍。

材料與方法

1.材料：HeLa細(xì)胞及293T細(xì)胞購自美國ATCC公司。慢病毒載體Lenti-Cas9-Blast、PSPAX2及PMD2.G購自美國Addgene公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000、殺稻瘟菌素、蛋白酶抑制劑(halt protease inhibitor cocktail, EDTA-free)購自美國Thermo Scientific公司。強(qiáng)力霉素、Hoechst 33258、生物素、碳酸氫銨、Triton X-100購自美國Sigma公司。Streptavidin-HRP 購自英國Abcam公司。兔抗人YB1單克隆抗體(D2B12)購自美國Cell Signaling Technology公司。兔抗人GAPDH單克隆抗體購自上海Abmart公司。限制性內(nèi)切酶、DNA ligation kit Ver 2.1、PrimeSTAR?Max DNA Polymerase高保真酶購自日本TaKaRa公司。切膠純化及PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自美國Omega公司。

2.基因及引物合成：北京博邁德公司合成載體構(gòu)建用引物(表1)及含TurboID編碼區(qū)的插入片段。該插入片段由多克隆位點(diǎn)MCS(包含BsrGⅠ、BstBⅠ、AgeⅠ、BSu36Ⅰ、SfiⅠ、XhoⅠ、PacI酶切位點(diǎn))、TurboID、HA標(biāo)簽序列、Tet-on系統(tǒng)(含Tight啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、殺稻瘟菌素抗性基因BSD、P2A序列及rtTA)組成，5′及3′末端分別加入KpnⅠ及EcoRⅠ酶切位點(diǎn)(圖1)[4～6]。

表1 載體構(gòu)建用引物列表

下劃線所示為括號(hào)內(nèi)的酶切位點(diǎn)

圖1 Lenti-TurboID載體的構(gòu)建路徑

3.Lenti-TurboID質(zhì)粒載體構(gòu)建：37℃下使用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切Lenti-Cas9-Blast質(zhì)粒，2%瓊脂糖凝膠電泳后回收7.5kb的片段lenti-NR。KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切含TurboID編碼區(qū)的合成片段，并與酶切的lenti-NR連接，獲得慢病毒質(zhì)粒載體命名為Lenti-TurboID (圖1)。送北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)公司使用表1中列出的測序引物進(jìn)行測序分析，以確保插入的合成基因序列完全正確。

4.TurboID-YB1及TurboID-GFP融合表達(dá)載體的構(gòu)建：以人YB1 cDNA全長質(zhì)粒克隆及pEGFP-C1載體(美國Clontech公司)為模板，使用表1中列出的擴(kuò)增引物，利用PrimeSTAR?Max DNA Polymerase高保真酶分別擴(kuò)增YB1及GFP的開放閱讀框編碼區(qū)，同時(shí)加入預(yù)設(shè)酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，紫外燈下切取YB1及GFP目的條帶并使用切膠純化試劑盒純化產(chǎn)物，回收產(chǎn)物分別使用BstBⅠ/Bsu36Ⅰ或AgeⅠ/Bsu36Ⅰ 37℃下酶切1.5～2.0h，產(chǎn)物純化后與經(jīng)同樣雙酶切的Lenti-TurboID載體連接，獲得融合表達(dá)載體TurboID-YB1及TurboID-GFP。

5.慢病毒包裝及侵染：6孔板內(nèi)種植4×105個(gè)293T細(xì)胞，次日參照Lipofectamine 3000說明書轉(zhuǎn)染TurboID-YB1、TurboID-GFP及輔助質(zhì)粒PSPAX2及PMD2.G，培養(yǎng)48h后收集含病毒培養(yǎng)基并使用0.45μm濾膜過濾后用于后續(xù)侵染。取適量病毒加入到融合度為50%的HeLa細(xì)胞中，培養(yǎng)24h后重懸細(xì)胞于含2μg/ml殺稻瘟菌素的DMEM高糖培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)14天，期間每隔2天更換1次新鮮培養(yǎng)基。

6.強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)濃度篩選：6孔板內(nèi)種植3×105個(gè)第5步獲得的融合表達(dá)TruboID-YB1的HeLa細(xì)胞，次日更換新鮮培養(yǎng)基并加入強(qiáng)力霉素，使其終濃度分別為0、0.125、0.25、0.5、1.0和1.5μg/ml。繼續(xù)培養(yǎng)24h后使用含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，取30μg細(xì)胞裂解物進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳。電泳產(chǎn)物利用濕轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)至PVDF膜，使用5% 脫脂牛奶室溫封閉60min，隨后加入含兔抗人YB1 單克隆抗體(1∶1000的稀釋比例)或兔抗人GAPDH單克隆抗體(1∶5000的稀釋比例)的一抗反應(yīng)液4℃振蕩孵育過夜。次日TBST洗5次后加入含有山羊抗兔IgG-HRP(1∶4000)的二抗反應(yīng)液室溫振蕩孵育1h。TBST洗3次后使用Millipore Immobilon Western試劑盒進(jìn)行曝光顯色，以檢測融合蛋白的表達(dá)量。

7.GFP表達(dá)量的檢測：24孔板內(nèi)使用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基及添加0.5μg/ml強(qiáng)力霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)第5步獲得的融合表達(dá)TruboID-GFP的HeLa細(xì)胞，培養(yǎng)24h后PBS洗滌1次，替換為4%的多聚甲醛溶液固定細(xì)胞5min，加入含10mg/L Hoechst 33258 的PBS溶液，室溫染色10min, 倒置熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況。

8.生物素標(biāo)記時(shí)間篩選：使用含0.125μg/ml強(qiáng)力霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24h以誘導(dǎo)TruboID-GFP融合蛋白的表達(dá)，PBS洗滌細(xì)胞2次，使用含50μmol/L生物素的無血清DMEM培養(yǎng)基分別處理TurboID-GFP和TurboID-YB1兩種細(xì)胞0、15、30、60和120min。PBS洗滌細(xì)胞2次，使用新鮮配制的裂解液[50mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，8mol/L尿素，1mmol/L DTT，1×Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free]裂解細(xì)胞。取20μg細(xì)胞裂解物進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳，產(chǎn)物轉(zhuǎn)至PVDF膜后使用BSA封閉液[PBS中含1%牛血清白蛋白，0.2% (w/v) Triton X-100]室溫封閉30min。按照1∶40000稀釋Streptavidin-HRP于BSA封閉液，4℃過夜孵育。在室溫下PBS洗膜3次去除未結(jié)合的抗體，使用ABS封閉液[PBS中含10%牛血清白蛋白，1% (w/v) Triton X-100]封閉5min。PBS洗膜3次后，使用Millipore Immobilon Western試劑盒檢測生物素標(biāo)記的蛋白。

結(jié) 果

1.慢病毒載體的構(gòu)建：參照圖1的構(gòu)建路線，經(jīng)測序驗(yàn)證，獲得的慢病毒表達(dá)載體TurboID-YB1及TurboID-GFP的序列完全正確。

2.強(qiáng)力霉素可有效誘導(dǎo)TurboID與目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的融合表達(dá)：不添加誘導(dǎo)劑強(qiáng)力霉素，細(xì)胞內(nèi)檢測不到融合蛋白TurboID-YB1。隨著強(qiáng)力霉素使用濃度的增加，融合蛋白TurboID-YB1在細(xì)胞中的表達(dá)量呈現(xiàn)出明顯的遞增關(guān)系，僅使用0.125μg/ml便可誘導(dǎo)目的蛋白YB1的表達(dá)，且其表達(dá)量與HeLa細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)的YB1蛋白接近(圖2)。

圖2 不同劑量的強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)融合蛋白TurboID-YB1在HeLa細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

為進(jìn)一步驗(yàn)證可誘導(dǎo)性這一特點(diǎn)，對(duì)照細(xì)胞(TurboID-GFP病毒侵染的HeLa細(xì)胞)進(jìn)行了強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)處理，結(jié)果顯示，不添加強(qiáng)力霉素時(shí)幾乎檢測不到GFP的表達(dá)，添加0.5μg/ml強(qiáng)力霉素處理可顯著提高目的蛋白GFP的表達(dá)(圖3)。

圖3 強(qiáng)力霉素可有效誘導(dǎo)對(duì)照細(xì)胞中GFP的表達(dá)綠色熒光，×200

3.TurboID系統(tǒng)可對(duì)目的蛋白及其鄰近的蛋白分子有效標(biāo)記生物素：使用50μmol/L的生物素處理融合表達(dá)TurboID-YB1的HeLa細(xì)胞，并使用Streptavidin-HRP進(jìn)行Western blot法檢測生物素標(biāo)記的蛋白。處理15min后兩類細(xì)胞系中均檢測到了大量生物素標(biāo)記的蛋白，同時(shí)隨著孵育時(shí)間的延長，被標(biāo)記蛋白的數(shù)量逐漸增多。將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞TurboID-YB1同對(duì)照組細(xì)胞TurboID-GFP中標(biāo)記的蛋白進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中可標(biāo)記更多種類的蛋白，尤其是在相對(duì)分子質(zhì)量>35kDa范圍內(nèi)的條帶種類明顯較對(duì)照組增多(圖4)。

圖4 Western blot法檢測攜帶生物素標(biāo)記的蛋白箭頭所指分別為融合表達(dá)的TurboID-GFP及TurboID-YB1蛋白

討 論

為研究生物體內(nèi)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，人們先后發(fā)展出了生化分餾技術(shù)、酵母雙雜交(yest two hybrid assay, Y2H)以及以免疫沉淀(immunoprecipitation, IP)為代表的親和純化(affinity purification,AP)等研究方法，并在國際范圍內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用。然而這些技術(shù)都存在一些固有缺陷：不容易捕捉瞬時(shí)或較弱的蛋白相互作用；需要過表達(dá)目的蛋白，因此并不能真實(shí)反映相關(guān)蛋白復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況；細(xì)胞裂解液往往會(huì)破壞目的蛋白在正常細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)分布等[2,6]。為彌補(bǔ)這些不足，以BioID和APEX為代表的鄰近蛋白質(zhì)標(biāo)記方法應(yīng)運(yùn)而生，其中BioID技術(shù)因其細(xì)胞毒性小、標(biāo)記效率高、適用性廣等優(yōu)點(diǎn)被大量采用。該技術(shù)于2012年被首次報(bào)道，至今已被超過100多篇研究用于解析細(xì)胞內(nèi)的蛋白組成[6，7]。但該技術(shù)仍然存在一些限制因素，主要體現(xiàn)在標(biāo)記時(shí)間過長(一般要>16h)，且標(biāo)記效率不高，因此無法捕獲瞬時(shí)或相互之間結(jié)合力弱的蛋白質(zhì)。為解決這些問題，先后衍生出了一系列改良型生物素連接酶，例如BioID2、BASU，但這些方法仍然無法從根本上解決這些問題[8，9]。Alice YTing科研團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種新的BirA突變體——TurboID，只需簡單用生物素處理10min，便可獲得與傳統(tǒng)BioID類似甚至更高的生物素標(biāo)記效率，徹底解決了制約BioID技術(shù)發(fā)展的瓶頸問題[4]。自首次報(bào)道以來短短1年時(shí)間內(nèi)，已被多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)成功應(yīng)用于植物及酵母等多個(gè)物種[10，11]。

本研究中筆者成功構(gòu)建了可以融合表達(dá)TurboID及目的蛋白的病毒載體系統(tǒng)。與之前的報(bào)道類似，僅對(duì)細(xì)胞做生物素處理15min以上，便可在HeLa細(xì)胞內(nèi)檢測到大量被生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)(圖4)[4]。另一方面，相對(duì)于最初報(bào)道的TurboID系統(tǒng)，本系統(tǒng)具有兩個(gè)突出的特點(diǎn)：(1)目的蛋白的表達(dá)量可以精確控制[4]：由于Tet-on系統(tǒng)的引入，TurboID及目的基因的融合表達(dá)完全受制于外加誘導(dǎo)劑——強(qiáng)力霉素濃度的高低，通過調(diào)整誘導(dǎo)劑的加入時(shí)間及使用濃度，可以精確控制目的基因的表達(dá)時(shí)間及表達(dá)量，獲得更貼近于生物體原本狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(圖2)[5]。(2)細(xì)胞適用性更廣：TurboID及傳統(tǒng)的BioID多以質(zhì)粒為載體，以293T細(xì)胞為研究對(duì)象，這主要是由于293T細(xì)胞具備質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率高、外源基因表達(dá)量高、細(xì)胞生長旺盛等特點(diǎn)。相對(duì)于質(zhì)粒系統(tǒng)，筆者構(gòu)建的病毒載體系統(tǒng)以lenti-cas9載體為基礎(chǔ)，具備病毒包裝效率高、細(xì)胞適用性廣的優(yōu)勢，可產(chǎn)生高效價(jià)的病毒，并廣泛應(yīng)用于分裂或原代培養(yǎng)的細(xì)胞，而不僅僅局限于293T這一類細(xì)胞[12，13]。

綜上所述, 本研究建立的TurboID體系提供了一種新型的探測蛋白質(zhì)相互作用和空間關(guān)系的方法，該方法可以應(yīng)用到多種細(xì)胞及多個(gè)物種，操作簡便快速, 可精確控制目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，具有廣闊的應(yīng)用前景。