不同消毒劑對HBV核酸和表面抗原的作用效果研究

邱 豐 周為民 尹文嬌 周文亭 曹經(jīng)瑗 畢勝利 武桂珍

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)隸屬于嗜肝DNA病毒科，是一種直徑42nm的雙鏈DNA病毒[1～3]。形態(tài)學(xué)上，HBV由一個27nm的核衣殼和外層包裹的脂蛋白膜共同組成，病毒核酸(HBV DNA)位于核衣殼內(nèi)，而HBV表面抗原(HBsAg)則鑲嵌在外層的脂蛋白膜中[4，5]。自然狀態(tài)下，過量的HBsAg常以直徑為22nm球形或管形顆粒在血液中循環(huán)[6，7]。

HBV對外界環(huán)境抵抗力較強，國內(nèi)外常將HBsAg和HBV DNA作為反映病毒是否滅活的指標[8～10]。很多文獻證實，30～32℃環(huán)境下HBV可存活至少6個月，-20℃時可存活15年。在某些極端條件下，例如121℃高壓20min、100℃干烤1h或者100℃直接煮沸10min可確保滅活HBV[11～13]。然而，對于實驗室濺灑、滴漏造成的HBV污染，高壓干烤等方式顯然并不適用。因此，探索各種不同的化學(xué)消毒劑對HBV的作用效果就顯得尤為必要，之前有研究資料表明，含氯制劑、環(huán)氧乙烷、戊二醛、過氧乙酸和碘伏對HBV的滅活效果比較好[14～17]。本研究進一步評價了衛(wèi)可(Virkon)、增效H2O2等新型消毒劑對HBV的作用效果。

材料與方法

1.實驗材料：選擇含氯消毒劑(有效氯濃度135～165mg/L)、1%衛(wèi)可、75%乙醇+增效劑、1.0%過氧化氫+增效劑、1.5%過氧化氫+增效劑5種，其中，含氯消毒劑購自南京凈朗源環(huán)保科技有限公司，產(chǎn)品批號20171214；維可購自美國杜邦公司；其余3種均購自北京華夏昱凱科技發(fā)展有限公司，產(chǎn)品批號分別為201901、201902、201902。HBV病毒原液來自于筆者實驗室監(jiān)測的急性乙型肝炎患者血清，保存于-20℃。原始血清中HBsAg含量為3000IU/ml，HBV DNA含量為5×106IU/ml。

表1 實時熒光定量PCR的引物和探針

結(jié) 果

1.病毒濃度(血清稀釋度)對消毒劑作用效果的影響：由于實驗室通常會面臨不同濃度的HBV陽性血清的濺灑情況，這些血清的病毒載量以及HBsAg濃度往往有成百上千倍的差別，為了模擬不同病毒載量和HBsAg的血清對消毒效果的影響，將實驗室保存的原始HBV陽性血清作了系列梯度稀釋，經(jīng)消毒劑作用1h后,對HBsAg和HBV DNA兩個指標進行檢測，發(fā)現(xiàn)不同消毒劑的作用效果存在差別。1.0%的過氧化氫和1.5%的過氧化氫對高、中、低濃度的HBV陽性血清均無效，所有稀釋度的血清經(jīng)作用1h后HBsAg和HBV DNA仍然為陽性，含氯消毒劑和75%乙醇對低濃度的HBV陽性血清有一定的效果，但對高濃度血清無效，在本研究所涉及的5種消毒劑中，只有1%衛(wèi)可對HBV核酸的破壞效果較為明顯(表2)。

表2 病毒濃度(血清稀釋度)對消毒劑作用效果的影響

2.不同劑量消毒劑對高濃度原始病毒的作用效果：為探索每種消毒劑最佳的使用劑量，分別使用了2倍、4倍、10倍、20倍和40倍的消毒劑與原倍HBV陽性血清作用1h，加入硫代硫酸鈉中和后測定了HBsAg和HBV DNA的含量。20倍體積的1%衛(wèi)可與原倍血清作用后可使HBsAg和HBV DNA兩項指標均發(fā)生陰轉(zhuǎn)，而其他兩種消毒劑都達不到類似效果，增大至40倍體積后仍有指標為陽性，詳見表3。

表3 不同劑量消毒劑對原倍HBV陽性血清的作用效果

3.作用時間對消毒劑效果的影響：由于1%衛(wèi)可消毒劑具有使用劑量較小、作用效果顯著等特點，在實驗室發(fā)生HBV陽性血清濺灑等生物安全事故時，其實用性要強于含氯消毒劑和75%乙醇。而表3的實驗數(shù)據(jù)已經(jīng)顯示20倍和40倍體積1%衛(wèi)可均能夠徹底破壞HBsAg和HBV DNA。在此基礎(chǔ)上進一步探索了20倍以及40倍體積1%衛(wèi)可的最佳處理時間，不論是20倍體積還是40倍體積，1%衛(wèi)可只有在作用1h之后才能使HBsAg和HBV DNA均發(fā)生陰轉(zhuǎn)(表4)。

表4 作用時間對1%衛(wèi)可消毒劑作用效果的影響

討 論

長期以來缺乏有效的HBV體外培養(yǎng)模型一直是HBV滅活效果評價的最大阻礙，雖然最近HBV的特異性受體及其體外培養(yǎng)系統(tǒng)取得了突破性的進展，但是該系統(tǒng)中使用的HepG2-NTCP細胞株不易獲得，而且HBV體外培養(yǎng)比較耗時費力，因此本研究選擇了HBsAg和HBV DNA這兩項廣泛使用的指標用于評價不同消毒劑的作用效果，一方面是因為這兩個指標的檢測方法比較成熟，操作簡便，價格低廉，檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性強；另一方面，HBsAg和HBV DNA作為HBV的兩種重要組成成分，在一定程度上也能代表消毒劑對病毒本身的作用效果[8，20]。

目前實驗室常用的消毒劑種類繁多，性狀各異，之前已有研究證實含氯消毒劑和乙醇處理后并不能使血清中的HBsAg抗原性達到陰性水平，這與本研究的實驗結(jié)果相符[14，15]。但是，本研究進一步發(fā)現(xiàn)，在血清中HBsAg含量較低的情況下(低于30IU/ml)，含氯消毒劑和乙醇的作用效果還是相當明顯的，這兩種實驗室最常用的消毒劑對于低濃度的HBsAg具有較好的破壞作用。

除傳統(tǒng)消毒劑之外，本研究還驗證了衛(wèi)可等新型消毒劑對HBsAg以及HBV DNA的作用效果。衛(wèi)可外觀為粉紅色粉末，是一種過硫酸氫鉀復(fù)合鹽，屬于酸性氧化劑，易溶于水，在實際使用中常配制成1%的溶液，衛(wèi)可的消毒機制在于通過產(chǎn)生低分子自由基使病原表面蛋白質(zhì)變性凝固從而殺滅微生物[21，22]。本研究發(fā)現(xiàn)，無論是高濃度還是中低濃度的HBV陽性血清，使用20倍體積以上的1%衛(wèi)可溶液處理1h之后均可使HBV DNA和HBsAg等指標轉(zhuǎn)陰，證實了衛(wèi)可良好的作用效果。除此之外，衛(wèi)可相較于其余種類的消毒劑還具備顯著的優(yōu)點。首先，衛(wèi)可配制方便，配好的溶液內(nèi)含有特有的粉紅色活性指示劑，可以通過顏色的變化判斷消毒劑的有效性。其次，衛(wèi)可揮發(fā)性不強，對人體皮膚、呼吸道黏膜和眼睛等部位的刺激較小，對金屬的腐蝕作用也比含氯消毒劑要弱，基本安全無害。最后，衛(wèi)可價格低廉，生產(chǎn)成本比醫(yī)用乙醇等大多數(shù)的消毒劑要低。

綜上所述，本研究通過HBsAg和HBV DNA等指標間接地評估了各種消毒劑的作用效果，研究結(jié)果對于實驗室處理HBV陽性血清濺灑等生物安全事故具有一定的參考價值。采用最新的病毒體外培養(yǎng)體系，建立成熟可靠的評價方法來直接測定HBV的感染性是今后努力的方向。