活動性肺結核患者外周血髓樣樹突狀細胞中BTLA與B7-H4共表達檢測及臨床意義

徐 歡 黃 紀 孫胤富 王萬黨 張俊愛 徐軍發

活動性肺結核是結核分枝桿菌感染引起的慢性傳染性疾病，目前其發病機制尚不明確，但細胞免疫在介導其發生、發展中發揮重要作用。筆者前期工作中發現，結核性胸膜炎患者外周血及胸水中樹突狀細胞及其亞群髓樣性DC比例顯著高于正常對照組，且與IL-12水平呈正相關。BTLA與B7-H4是近年來發現的免疫檢查點抑制因子(immune checkpoint inhibitors)，表達在T細胞上的BTLA通過HVEM-BTLA信號途徑抑制T細胞的增殖、分化和多種細胞因子的分泌[1]。筆者前期研究中發現BTLA和B7-H4在肺結核患者外周血CD11c+抗原遞呈細胞中高表達，且表達BTLA和B7-H4的CD11c+APC活化同種T細胞的能力下降，提示BTLA和B7-H4對抗原遞呈細胞抗結核免疫有重要影響[2]。而mDC是CD11c+抗原遞呈細胞中最主要的細胞之一[3]。在體內能活化初始T細胞的抗原遞呈，在固有性和適應性結核免疫中發揮重要作用[4]。在活動性肺結核患者中，檢查點抑制分子BTLA和B7-H4對mDC的抗結核免疫的影響尚不清楚，本研究采用流式細胞技術對46例診斷為活動性肺結核的患者外周血mDC中BTLA及B7-H4共表達情況進行了檢測，分析其與mDC表面成熟標志分子CD83、抗原遞呈分子HLA-DR以及共刺激分子CD86表達的相關性，探究其臨床意義。

資料與方法

1.研究對象:46例活動性肺結核患者及23例健康對照均來自廣東醫科大學附屬厚街醫院。排除標準：①妊娠;②酗酒;③年齡<16歲或>65歲;④HIV陽性;⑤其他傳染病和慢性疾病(如糖尿病);⑥近1個月內服用激素等治療的患者。根據抗結核藥物治療情況，本研究中將活動性肺結核患者分為抗MTB藥物治療前(prior treatment，PRT)組和治療后(post treatment，POT)組，其中，治療<3天者為治療前，治療2周者為治療后。本研究經過廣東醫科大學附屬厚街醫院和廣東醫科大學醫學倫理學委員會批準，已征得研究對象的知情同意。

2.主要試劑和儀器:流式抗體分別為Lin1-FITC(為混合抗體，包括FITC標記的CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56的抗體，克隆號是SK7、3G8、SJ25C1、L27、eMfP9、NCAM16.2)購自美國BD公司；BTLA-APC(MIH26，Biolegend)，B7-H4-P (H74，eBioscience)，CD83- PerCP-CyTM5.5(HB15，Biolegend)，CD11c- APC-eFluor780(BU15，eBioscience)，HLA-DR- PE-Cyanine7(LN3，eBioscience)，以及各自同型抗體均購自美國eBioscience公司。人淋巴細胞分離液購自美國GE公司，FACS-CantoⅡ流式細胞儀型號為美國BD公司產品。

3.外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)的分離：具體方法參考文獻[5]，肝素鈉抗凝血5ml離心1500r/min,5min，上清血漿與-80℃凍存；血液細胞與無菌0.9%氯化鈉溶液1∶1混合稀釋，將稀釋液緩慢加入淋巴細胞分離液上，室溫870×g離心30min，分離單個核細胞。

4.流式細胞術檢測mDC共表達BTLA和B7-H4以及BTLA、B7-H4雙陽性mDC和 BTLA、B7-H4雙陰性mDC表達CD83、HLA-DR和CD86:取100μl含1×106個PBMC于流式管中，加入推薦量熒光團標記的抗體(CD83-PerCP-CyTM5.5、HLA-DR- PE-Cyanine7、CD11c- APC-eFluor780、Lin1-FITC、BTLA-APC、B7-H4-PE、CD86-FITC)，以相同的方式各加入各自相應同型抗體作為對照。振蕩混勻，4℃避光孵育30min；加入2ml洗滌液洗2次，棄上清；加入200μl 10g/L多聚甲醛溶液，輕輕混勻，4℃避光保存。24h內上機檢測分析，采用FlowJo 7.6.1軟件進行數據分析。

結 果

1.BTLA和B7-H4在活動性肺結核患者外周血中高表達:采用流式細胞技術檢測APT患者外周血來源mDC中BTLA和B7-H4共表達情況。結果顯示患者外周血mDC中BTLA和B7-H4共表達水平顯著高于健康對照組(圖1A，P=0.000)，AUR=0.9282(圖1B)。

圖1 BTLA和B7-H4在活動性肺結核患者(APT)外周血mDC中高表達

2.BTLA和B7-H4在治療前后、初治與復治患者中DP-mDC表達情況：10例患者經1個月治療后DP-mDC比例顯著下降(圖2A，P<0.01)。復治患者中表達顯著高于初治患者(圖2B，P<0.05)。

圖2 治療前后、初治與復治患者中DP-mDC表達情況

3.BTLA和B7-H4共表達mDC中CD83的表達:健康對照組和APT外周血共表達BTLA和B7-H4的mDC中表達CD83的陽性率均顯著高于不表達BTLA和B7-H4的mDC(圖3中A、B，P=0.000)。但患者外周血中共表達和不表達BTLA和B7-H4的mDC中CD83的表達高于健康對照組(圖3C，P<0.05)。

4.BTLA和B7-H4共表達mDC中HLA-DR表達:健康對照組和患者組外周血共表達BTLA和B7-H4的mDC中表達HLA-DR的陽性率均顯著高于不表達BTLA和B7-H4的mDC(圖4中A、B，P=0.000)。但患者外周血中共表達BTLA和B7-H4的mDC和不表達BTLA和B7-H4的mDC中HLA-DR的表達均顯著低于健康對照組(圖4C，P=0.000)。

圖3 DP-mDC、DN-mDC中CD83的表達

圖4 DP-mDC、DN-mDC中HLA-DR的表達

5.BTLA和B7-H4共表達mDC中CD86表達：健康對照組和患者組外周血共表達BTLA和B7-H4的mDC中表達CD86的水平顯著低于不表達BTLA和B7-H4的mDC(圖5中A、B，P<0.01)。但患者外周血中共表達和不表達BTLA和B7-H4的mDC中CD86的表達均顯著高于健康對照組(圖5C，P=0.000)。

圖5 DP-mDC、DN-mDC中CD86的表達

討 論

筆者的研究結果發現共表達BTLA和B7-H4的mDC在TP患者外周血中顯著高于健康對照組; APT外周血中DP-mDC的表達顯著高于健康對照組，復治患者中比例顯著高于初治患者，經過1個月治療DP-mDC比例顯著降低。進一步研究發現，在健康對照和患者外周血中，DP-mDC表達CD83和HLA-DR都顯著高于DN-mDC,而CD86在DP-mDC中的表達水平低于DN-mDC。APT外周血中DP-mDC和DN-mDC表達CD86和CD83水平都顯著高于健康對照組，但APT外周血中DP-mDC和DN-mDC表達HLA-DR的水平顯著低于健康對照組。以上結果提示BTLA和B7-H4在活動性肺結核中可能影響mDC的抗結核免疫。

樹突狀細胞(DC)在抗結核中發揮著重要作用，APT患者mDC上高表達BTLA和B7-H4可能介導結核桿菌的免疫逃逸，BTLA主要表達在T細胞和一些髓原性細胞上，表達在T細胞上的BTLA可與配體HVEM作用來抑制T細胞增殖與活化，并抑制T細胞分泌多種細胞因子[1]。在活動性肺結核患者CD4+和CD8+T細胞高表達BTLA，BTLA通過抑制T細胞的活性參與結核病的進展[6]。在免疫性疾病系統性紅斑狼瘡患者中Th1、Th2和Th17效應T細胞上的BTLA表達與活動性疾病相關,BTLA作為共抑制分子在系統性紅斑狼瘡患者T細胞穩態和疾病活動中發揮重要作用[7]。肝細胞癌中BTLA抑制T細胞功能參與其免疫進程，免疫抑制分子BTLA有望成為新的腫瘤免疫治療靶點[8]。筆者前期研究發現，APT外周血CD11c+抗原遞呈細胞高表達BTLA，且BTLA的表達與CD11c+抗原遞呈細胞活化同種T細胞功能下降相關[2]。目前筆者的結果顯示DP-mDC在APT外周血中的表達顯著高于健康對照組，復治患者中比例顯著高于初治患者，經過1個月治療DP-mDC比例顯著降低。提示在ATP中，結核桿菌可能通過升高BTLA來抑制mDC的功能，并且通過mDC高表達B7-H4來抑制T細胞的免疫活性，最終影響機體的抗結核免疫。經治療后BTLA和B7-H4表達水平降低，BTLA對mDC的抑制作用也隨之降低, mDC通過B7-H4對T細胞的抑制作用也降低。

CD83分子是成熟DC細胞表面重要的標志分子，參與DC細胞功能的調節。用結核菌體或菌體抗原體外刺激可誘導其成熟并且高表達CD83[9,10]。筆者前期研究發現，在結核性胸膜炎患者中mDC活化成熟，高表達CCR7和CD83[11]。BTLA不僅在T細胞的表面高表達，在成熟的DC細胞上也有表達。BTLA在T細胞上的表達可抑制其增殖活化和多種細胞因子的分泌。成熟DC細胞在高表達CD83的同時也高表達免疫負向調節因子，包括BTLA和B7-H4[12]，其在DC 細胞上的表達可能對其功能有影響。Kobayashi等[13]研究發現BTLA可抑制LPS刺激時DC和巨噬細胞的功能，BTLA-/-小鼠極易發生LPS誘導的內毒素休克。有研究發現腺病毒介導的CCR7和BTLA過表達可增強未成熟樹突狀細胞的免疫耐受性和遷移[14]。筆者研究發現，無論是APT還是健康對照組其外周血DP mDC 表達CD83的比例都顯著高于DN mDC，這些結果顯示APT外周血中DP mDC相對成熟，提示檢查點共抑制分子BTLA和B7-H4可能傾向于表達在成熟的mDC上，表達在成熟mDC上的共抑制分子一方面可抑制其進一步的活化，最終抑制CD83的升高；另一方面可抑制T細胞的活化，大道維持mDC的免疫自穩，目前，筆者也進一步發現ATP患者DP mDC和DN mDC表達CD83都顯著高于健康對照，提示ATP患者中的DC是相對成熟活化的，在機體的抗結核免疫中具有重要的作用。而BTLA和B7-H4在ATP患者mDC中高表達也進一步地說明它們可能具有抑制mDC的免疫活性的特點。

抗原遞呈分子HLA-DR可遞呈抗原給T細胞，刺激T細胞的活化。成熟的DC也高表達HLA-DR。筆者的研究發現無論是APT還是健康對照組其外周血DP mDC表達HLA-DR的水平都顯著高于DN mDC，這同樣說明了DP mDC是相對成熟的DC，這提示檢查點共抑制分子BTLA和B7-H4傾向于在成熟活化的mDC上表達，其可能作用是對mDC免疫活性產生抑制，維持其免疫自穩。筆者的結果發現在APT外周血中DP mDC 表達HLA-DR顯著低于健康對照組，可能原因是患者外周血mDC高表達BTLA和B7-H4，高表達的BTLA和B7-H4可能抑制了mDC的免疫活性。結核菌或卡介苗感染抗原遞呈細胞后，HLA-DR的表達受到抑制[15]。結核菌感染小鼠模型中DC表達MHC-2也是降低的。這可能與結核菌感染導致mDC高表達BTLA有關，過高表達的BTLA可能抑制了DC表達HLA-DR。這可能是結核病患者DC免疫功能低下的一個原因。另一方面則通過增加B7-H4表達抑制HLA-DR對T細胞的激活作用。

CD86是在抗原遞呈細胞上表達的分子，在T細胞的增殖分化中發揮重要作用。筆者的研究發現正常對照組和患者組外周血共表達BTLA和B7-H4的mDC中表達CD86的水平顯著低于不表達BTLA和B7-H4的mDC，但患者外周血中共表達BTLA和B7-H4的mDC和不表達BTLA和B7-H4的mDC中CD86的表達均顯著高于健康對照組。有研究表明，結核菌感染后DC較高表達CD80和CD86[16]。筆者最近研究發現，在APT中表達BTLA的CD11c+抗原遞呈細胞CD86表達增加[2]。APT患者CD86表達的增高一方面可激活免疫系統，增強T細胞介導的殺菌作用；另一方面可能是對APT患者中DC功能降低進行補償，達到抗結核作用。

綜上所述，本研究結果顯示APT外周血mDC高表達BTLA和B7H4比例顯著升高，進行有效的抗結核治療后，mDC共表達BTLA和B7-H4的比例明顯降低；高表達BTLA和B7-H4影響mDC的成熟以及HLA-DR的表達，提示在APT中BTLA和B7-H4可負向調節mDC的免疫活性，有可能是結核菌的免疫逃逸機制。BTLA和B7H4調節DC成熟的機制尚不清楚，共表達BTLA和B7-H4的mDC的免疫功能還有待于進一步闡明。