PSMB8在人絨毛膜滋養層細胞中對細胞凋亡和自噬的影響

欒曉瑾 顏一丹 陳 霞 王 敏 陳萬銀 鄭倩雯 謝 冰 于 駿 方 杰

稽留流產是指胚胎停止發育后仍滯留于宮腔內無法自行排出，是早期妊娠的并發癥之一[1]。近年來稽留流產發生率逐漸攀升，高達15%～20%[2]?；袅鳟a的發病機制尚不明確，其病因主要涉及染色體異常、感染和自身免疫性疾病、內分泌失調等方面[3]?；袅鳟a嚴重威脅了女性的健康，死亡的胚胎及病變的胎盤組織滯留于宮腔中釋放凝血活酶，易引發凝血功能紊亂[4]。清宮所導致的子宮內膜損傷會誘發宮腔粘連及不孕，給患者帶來巨大的心理傷害，故探索稽留流產的發病機制顯得尤為重要。

胎盤是在母體系統和胎兒系統之間運輸營養物質、呼吸氣體和廢物的重要器官。胎盤的早期發育依賴于囊胚腔外圍的絨毛滋養細胞對子宮內膜的植入和侵襲[5]。有證據表明，稽留流產患者絨毛和蛻膜組織中凋亡及自噬的相關蛋白均有異常表達。肝素結合表皮生長因子(HB-EGF)和叉頭轉錄因子3α(FOXO3α)在稽留流產患者絨毛及蛻膜組織中均表達上調，提示滋養細胞凋亡受到抑制，導致宮腔內的死胎無法及時排除[6,7]。自噬過程關鍵因子Beclin-1蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值在稽留流產患者絨毛及蛻膜組織中均上調，提示滋養細胞自噬增強參與了稽留流產的發生[8]。然而，由于滋養細胞凋亡和自噬功能異常而導致稽留流產發病的具體機制尚未明確。有研究者對稽留流產患者和正常妊娠女性絨毛組織進行蛋白質組學研究和生物信息學分析，得到了51個差異表達的蛋白，其中免疫蛋白酶體亞基PSMB8(proteasome subunit beta 8)差異有統計學意義(FC=1.37，P<0.05)，可能是誘導稽留流產發生、發展的關鍵因子[9]。

PSMB8，又稱大型多功能蛋白酶7(large multifunctional protease 7，LMP7)，編碼蛋白酶體的β5i亞基[10]。細胞內普遍存在的蛋白酶體是26S標準型蛋白酶體，由一個核心的20S蛋白酶體和兩個具有調節作用的19S蛋白酶體組成，水解大多數蛋白質[11]。當受到氧化應激、炎性反應等刺激誘導時，20S蛋白酶體的β1、β2、β5亞基可相應被β1i、β2i、β5i取代，并且與兩個11S調節亞基PA28組裝成免疫型蛋白酶體，增強蛋白酶體與主要組織相容性抗原(MHC-1)相結合多肽的能力[12]。對于清除細胞內有害的蛋白質，維持細胞穩態具有重要作用。研究表明，PSMB8對免疫型蛋白酶體的加工極為重要，它是β1i 和β2i 前肽翻譯后加工必不可少的[13]。目前，尚未有文獻報道其在稽留流產中的作用。本研究旨在探討PSMB8對人絨毛膜滋養細胞HTR-8/Svneo(簡稱HTR-8)凋亡及自噬能力的影響，初步探討PSMB8導致稽留流產可能的機制，以期為稽留流產發病機制的研究提供新的思路。

材料與方法

1.材料與試劑：HTR-8細胞系購自美國ATCC細胞庫、1640培養液及Opti-Mem培養液購自美國Gibco公司，胎牛血清及胰酶購自以色列Bioind公司,Oligo-fectamineTM 2000試劑購自美國Invitrogen公司,PSMB8 siRNA質粒及NC siRNA質粒設計并購自中國吉瑪基因公司，TUNEL凋亡細胞檢測試劑盒及CCK-8細胞增殖試劑盒購自中國諾唯贊公司，Annexin Ⅴ Alexa Flμor647/PI凋亡檢測試劑盒購自中國福麥斯生物有限公司，caspase-3(cleaved)及LC3一抗購自美國Cell Signaling Technology公司，488標記抗兔IgG(H+L)熒光二抗購自美國Jackson公司，反轉錄試劑盒及qRT-PCR用SYBRGreen染料購自日本TaKaRa公司，qRT-PCR引物購自中國生工生物公司，Real-timePCR儀QuantStudio?5購自美國Thermo公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

2.細胞培養：HTR-8細胞采用含10%胎牛血清、青霉素(100nmol/ml)、鏈霉素(100μmol/ml)的1640培養基，在37℃、含有5%CO2培養箱內進行孵育，細胞呈貼壁生長。

3.PSMB8基因沉默處理：將HTR-8細胞按1.5×105個細胞/毫升接種于6孔板，待細胞生長至80%進行轉染，操作按脂質體Oligo-fectamineTM 2000試劑說明書進行。分別用Opti-MEM培養基稀釋不同體積的siRNA和轉染試劑，設置25、50、100 nmol/L濃度進行轉染。每次轉染均設對照組，轉染無義空白鏈(NC) siRNA。轉染6h后換為完全培養基，48h后行qRT-PCR觀察結果以篩選出干涉效率較高的siRNA序列進行后續實驗。siRNA信息描述詳見表1。

表1 siRNA序列

4.CCK8檢測細胞增殖：將HTR-8細胞用不含EDTA的胰酶消化后接種于96孔板中，每孔細胞數為2.5×103個，待細胞貼壁后按材料與方法3進行細胞轉染，分別于轉染后0、24、48h這3個時間點加入10μl CCK-8溶液并置于孵箱內避光孵育1h，用酶標儀測定450nm處吸光度值，每個樣本做3個副孔。

5.TUNEL法檢測細胞凋亡：將轉染24h后的HTR-8細胞，接種于放置有圓形玻片的24孔板內，繼續培養24h后進行TUNEL檢測。根據試劑盒操作說明進行試驗操作，于熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡數并拍照。用Image J記錄凋亡細胞數，根據凋亡細胞數對結果進行統計分析。

6.流式細胞術分析細胞凋亡情況：用不含EDTA的胰酶收集6孔板中轉染24h后的細胞，4℃預冷的PBS洗細胞2次后，用300μl結合緩沖液重懸，調節其濃度為1×106/ml，每管加入2.5μl Annexin Ⅴ/Alexa Flμor 647 和5μl PI溶液染色，室溫避光孵育15min后用流式細胞儀進行分析。該實驗重復3次。

7.免疫熒光檢測caspase-3 (cleaved)和LC3蛋白的表達：將轉染24h后的HTR-8細胞，接種于放置有圓形玻片的24孔板內，繼續培養24h后進行免疫熒光實驗。用4%多聚甲醛固定20min，用含0.1% 聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)的PBS清洗3次，每次10min，用5%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉30min，分別加入caspase-3(cleaved)和LC3一抗于室溫孵育1h后再用含0.1% TritonX-100的PBS清洗3遍。再用二抗于室溫孵育1h，最后用含0.1% TritonX-100的PBS清洗，去除多余的二抗，用100μl 1.0mg/ml的Hoechst33342染DNA 15min后，用防熒光淬滅劑封片。HTR-8細胞免疫熒光圖片通過熒光顯微鏡采集，每幅圖像取3個不同視野，并根據陽性細胞率進行分析。

8.qRT-PCR檢測PSMB8及自噬相關基因mRNA表達水平：將培養48h的兩組HTR-8細胞采用TRIzol法提取總RNA，紫外分光光度計測量RNA濃度。采用反轉錄試劑盒合成cDNA。SYBR熒光染料、cDNA、引物用來配制PCR反應體系。反應條件為95℃預變性2min；95℃變性15s，60℃退火20s，共40個循環。Ct值應用2-ΔΔCt方法處理，每個基因的相對表達量按照內參的表達量進行標準化處理。每個樣本有3個副孔，該實驗重復3次。詳細的引物序列見表2。

結 果

1.PSMB8 siRNA干涉效率驗證：與對照組比較，各siRNA轉染組PSMB8 mRNA相對表達水平均有不同程度的下調，在100nmol/L siRNA的濃度下，PSMB8 siRNA-1的轉染效率最高，可下調約70%。因此，本研究選擇在HTR-8細胞中轉染100nmol/L PSMB8 siRNA-1進行后續的功能研究實驗(圖1A)。

表2 qRT-PCR引物

2.PSMB8 siRNA抑制HTR-8細胞增殖：在HTR-8細胞內沉默PSMB8基因后，與對照組比較，PSMB8 siRNA-1組細胞增殖能力減弱，兩組細胞450nm處吸光度值24h及48h之間的差異均有統計學意義(P<0.05，圖1B)。

圖1 PSMB8 siRNA干涉效率驗證及對HTR-8細胞增殖的影響A.對照組和PSMB8 siRNA組細胞中PSMB8 mRNA的相對表達水平；B.PSMB8表達下調對細胞增殖能力的影響；與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01,***P=0.000

3.PSMB8 siRNA促進HTR-8細胞凋亡：TUNEL法檢測PSMB8 siRNA對HTR-8細胞凋亡效應的影響，與對照組比較，PSMB8 siRNA-1組的TUNEL陽性細胞比例增多(15.05±2.62 vs 33.40±2.44,P=0.000，圖2A、圖2C)。使用免疫熒光染色檢測細胞內凋亡關鍵蛋白caspase-3(cleaved)表達情況，與對照組比較，PSMB8 siRNA-1組中caspase-3(cleaved)蛋白陽性細胞比例增多(21.70±5.87 vs 53.29±10.29,P<0.01,圖2B、圖2D)。應用流式細胞術檢測細胞凋亡，與對照組比較，PSMB8 siRNA-1組中存活細胞明顯減少(89.10±0.78 vs 77.00±1.68,P=0.000)，早期凋亡和晚期凋亡細胞所占比例增高(9.09±0.65 vs 10.71±0.61,P<0.05)，壞死細胞所占比例也增高(2.49±0.73 vs 12.49±2.02,P<0.01，圖3)。

圖2 PSMB8 siRNA導致HTR-8細胞內凋亡細胞增多A.對照組和PSMB8 siRNA-1組進行TUNEL檢測(×400)，TUNEL(紅色)，DNA(藍色)，標尺50μm; B.對照組和PSMB8 siRNA-1組進行免疫熒光染色(×400)，caspase-3(cleaved)(綠色)，DNA(藍色)，標尺50μm; C.對照組和PSMB8 siRNA-1組中TUNEL陽性細胞率柱狀圖；D.對照組和PSMB8 siRNA-1組中caspase-3(cleaved)陽性細胞率柱狀圖; *P<0.01，**P=0.000

圖3 流式檢測PSMB8 siRNA對HTR-8細胞凋亡的影響A.對照組和PSMB8 siRNA-1組流式細胞術檢測凋亡分布情況;B.細胞凋亡情況數據統計柱狀圖; *P<0.05，**P<0.01，***P=0.000

4.PSMB8 siRNA誘導HTR-8細胞自噬：使用免疫熒光染色檢測細胞內自噬標志蛋白LC3的表達情況，與對照組比較，PSMB8 siRNA-1組中產生LC3蛋白熒光的細胞數量增加(19.02±3.78 vs 31.90±4.87,P<0.05)。qRT-PCR檢測自噬相關基因ULK1、Atg14、Atg5、Atg12、Atg3、Atg7 mRNA轉錄水平，與對照組比較，PSMB8 siRNA-1組中各基因mRNA表達均上調，且差異有統計學意義(P<0.05,圖4)。

圖4 PSMB8 siRNA導致HTR-8細胞內自噬水平增強A.對照組和PSMB8 siRNA-1組進行免疫熒光染色(×400)，LC3(綠色)，DNA(藍色)，標尺50μm; B.對照組和PSMB8 siRNA-1組中LC3陽性細胞率柱狀圖; C.對照組和PSMB8 siRNA-1組中自噬相關基因mRNA相對表達水平柱狀圖; *P<0.05，**P<0.01

討 論

滋養細胞在多種機制的共同作用下調控其增殖、凋亡、分化及血管重塑等功能，以確保胚胎的正常發育。滋養細胞功能障礙將導致多種不良妊娠結局的發生，如流產、胎兒生長受限、早產等。稽留流產是自然流產的一種特殊類型，其發病機制仍需進一步闡明。PSMB8是在稽留流產絨毛組織的蛋白質組學譜系中被鑒定到差異蛋白之一，與絨毛滋養細胞的功能關系密切，但其功能尚不明確。本研究以HTR-8為研究對象，旨在研究PSMB8對HTR-8細胞凋亡及自噬的影響，了解PSMB8在HTR-8細胞凋亡及自噬過程中產生的作用。

PSMB8作為免疫型蛋白酶體的關鍵亞基，已被證實具有影響細胞凋亡的能力。比如，PSMB8通過介導ERK1/2和PI3K/AKT信號通路調控膠質瘤細胞的凋亡、遷移和侵襲，在多發性骨髓瘤細胞中加入PSMB8靶向抑制劑后導致細胞增殖減少，凋亡增加[14，15]。本研究在HTR-8細胞中沉默PSMB8基因后，CCK8、流式細胞術及TUNEL檢測法的結果一致表明HTR-8細胞凋亡水平明顯增高，說明PSMB8對滋養細胞的凋亡功能產生了影響。半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族是直接導致細胞凋亡分解的蛋白酶系統，其中caspase-3參與了兩條觸發凋亡的主要通路，分別是細胞膜死亡受體介導的外源性凋亡途徑和線粒體介導的內源性凋亡途徑，在細胞凋亡過程中占據重要地位[16]。正常情況下，caspase-3以無活性的酶原狀態存在，在相應酶切位點之間進行剪切后產生有活性的caspase-3(cleaved)，介導凋亡的發生。免疫熒光結果顯示，敲減PSMB8后caspase-3(cleaved)蛋白比率明顯上升，表明PSMB8 siRNA可能是通過激活細胞內凋亡關鍵調控蛋白caspase-3，引發多種凋亡途徑，從而誘導滋養細胞的凋亡。

自噬-溶酶體途徑(autophagy-lysosome pathway，ALP)是不同于凋亡的一種程序性死亡方式。它是指胞質內雙層膜包裹部分胞質和細胞內需降解的細胞器、蛋白質等成分形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹內容物的過程，需要Atg家族及多種蛋白因子的參與[17]。Agt1(ULK1)、Agt14參與了自噬體的形成，Atg5-Atg12復合物和微管相關蛋白1輕鏈3 (microtubule- associated protein1 light chain 3，LC3)對于自噬體的延伸和成熟極為重要。LC3包括兩種可相互轉化的形式LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，當自噬被誘導后LC3Ⅰ在Atg3、Atg7等因子的作用下轉化為LC3Ⅱ與自噬體膜結合[18]。本研究中，PSMB8表達下降后，免疫熒光檢測自噬標志LC3陽性率明顯增高并且自噬相關基因ULK1、Agt14、Atg5、Atg12、Atg3、Atg7 mRNA表達水平均上調，提示PSMB8 siRNA通過誘導自噬體形成和延伸階段來增強細胞的自噬水平。

研究顯示自噬與凋亡的關系十分復雜，一方面自噬可以通過降解促凋亡蛋白來抑制細胞凋亡[19]；另一方面，當細胞自噬過度激活后將會活化線粒體中的前凋亡因子來誘導凋亡的發生[20]。因此，除了PSMB8表達下調對HTR-8細胞凋亡的直接誘導作用之外，沉默PSMB8后細胞內高水平的自噬也可能是誘導細胞凋亡的機制之一。

細胞內蛋白質的降解主要通過兩種途徑，包括ALP和泛素-蛋白酶體系統(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)。UPP是一種廣泛存在于真核細胞內的依賴ATP 的非溶酶體降解途徑，能夠快速地降解一些錯誤折疊的和短暫控制基本細胞生命活動的調節蛋白，來維持細胞的正常生物學功能[21]。越來越多的證據表明ALP和UPP相互影響，當UPP功能受損時，未折疊的蛋白質積累，從而誘導自噬水平代償性增高。在經過乙醇處理后的大腦皮質中，免疫蛋白酶體被誘導活化，標準型蛋白酶體亞基表達下降，大量泛素化的蛋白質無法分解，同時導致ALP受到抑制并且自噬體的體積發生變化。因此，沉默PSMB8后導致蛋白酶體功能受損，誘導HTR-8細胞內自噬水平補償性上升，可能是細胞內自噬水平增強的機制，但是仍需要更深入的研究進行解釋。

綜上所述，本研究結果表明在HTR-8細胞內下調PSMB8的表達可以誘導滋養細胞凋亡并且激活自噬，初步發現PSMB8參與稽留流產發生、發展的作用機制，為進一步研究稽留流產發病機制提供新的思路。