高效液相色譜法同時測定大黃中沒食子酸和肉桂酸的含量

張乾旭 劉國亮 張乾毅

（1 廣州中醫藥大學附屬第二醫院 廣東 廣州 510120）

（2 中山大學附屬腫瘤防治中心 廣東 廣州 510060）

大黃有唐古特大黃、正品大黃和藥用大黃的根莖及干燥根[1]。大黃適宜內服外用，能攻守、能止血、能通阻、能解毒[2]。大黃在加熱蒸炒炮制的過程中，成分含量變化很大，藥效隨之發生變化[3]。中藥炮制前后藥性改變，其化學成分含量增減變化[4]。目前大黃在臨床上主要用于治療急腹癥等疾病，該方劑在輔助改善腦血管病人意識等方面也有很好的療效[5]。據研究表明，大黃具有止血作用的主要藥效成分是鞣質中含的沒食子酸和兒茶素[6]；研究者等以往的研究多數以對大黃及其大黃炮制品前后蒽醌類的成分含量差異指標居多[7]，而對鞣質類成分含量差異比較這方面的研究居少。本研究采用HPLC 法建立中藥大黃沒食子酸、肉桂酸成分的含量測定方法，為其質量評價標準研究提供試驗依據。

1.儀器與試藥

1.1 儀器

2695 型高效液相色譜儀(美國沃特世公司）；1780 型紫外分光光度計(島津儀器（蘇州）有限公司)；電子分析天平(賽多利斯科學儀器（北京)有限公司)。

1.2 試藥

甲醇（色譜純，美國Fisher 科學世界公司）；甲醇、乙醇、磷酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；沒食子酸（批號：180921，上海融禾醫藥科技有限公司）；肉桂酸（批號：20181125，寶雞市晨光生物科技有限公司），純度＞98%。

2.方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱選擇：Thermo SCIENTIFIC Hypersil GOLD Dim.(mm)(4.6mm×250mm，5μm)流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液，依照表1 進行梯度洗脫，檢測波長278nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃，進樣量為10μl，按照上述條件各組分離分離度良好，見圖1。

表1 梯度洗脫表

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸對照品6.25mg，肉桂酸3.82mg 置于10ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，即得各對照品儲備液。再分別精密器量取上述沒食子酸對照品儲備液1ml，肉桂酸對照品儲備液0.5ml 于10ml 容量瓶中，搖勻，加甲醇稀釋定容到刻度，即沒食子酸濃度62.50ug/ml，肉桂酸濃度19.10ug/ml。

2.1.3 大黃樣品制備 精密稱取中藥大黃粉末0.5g，置具塞錐形瓶中，精密加入20ml65%甲醇，稱定重量，超聲30min，放冷，再稱定重量，用65%甲醇補足減失的重量，搖勻，離心，濾過，取續濾液，即得。

3.方法學考察

3.1 線性關系考察

精密吸取大黃混合對照品溶液2ul、5ul、8ul、10ul、12ul、15ul、20ul 分別注入高效液相色譜儀，各進樣1 次，測定相應條件下的峰面積，以峰面積為縱坐標，以進樣量(ug)為橫坐標，制得標準曲線并計算相對應的回歸方程。各組分在各自的含量范圍內線性關系良好，結果見表2。

表2 大黃不同炮制品的線性方程及線性范圍

3.2 精密度試驗

精密稱取大黃粉末0.5g，按“2.1.1”項下的色譜條件以及流動相條件進樣，記錄各自的峰面積，連續進行6 次，并計算沒食子酸、肉桂酸峰面積的RSD。結果測得混合對照品中沒食子酸、肉桂酸面積的RSD 值分別為1.28%、和0.62%，RSD 都小于3.0%，表明所用液相色譜儀的精密度較好。

3.3 穩定性試驗

精密稱定大黃粉末0.5g，置具塞錐形瓶中，按“2.1.3 大黃樣品制備成樣品溶液”項下的方法，分別于在0、2、4、8、12、24 h 按“2.1.1”項下的色譜條件進樣，測定各樣品的峰面積，結果測得沒食子酸、肉桂酸峰面積的RSD 分別為2.08%、1.62%。2 種成分的RSD 值小于3.0%，說明樣品在24h 內保持良好的穩定性。

3.4 重復性試驗

精密稱取大黃不同炮制品藥材粉末0.5g，每種炮制品均稱取6 份，按“2.1.3 大黃樣品制備成樣品溶液”項下的方法，按“2.1.1”項下的色譜條件進樣，測定各樣品的峰面積，結果測得沒食子酸和肉桂酸的含量分別為3.8962mg/g、0.7482mg/g；結果測得沒食子酸和肉桂酸的RSD 分別為1.82%、2.26%，其RSD 值均小于3.0%，表明該方法重復性良好。

3.5 加樣回收率試驗

精密稱取大黃藥材粉末025g，精密稱定9 份，分成低、中、高加樣組，每組分別加入混合對照品溶液，按“2.1.3 大黃樣品制備成樣品溶液”項下的方法，按“2.1.1”項下的色譜條件進樣，計算大黃低、中、高加樣組中的沒食子酸和肉桂酸的平均回收率和其RSD 值，結果見表3，表明該方法準確性良好。

表3 大黃加樣試驗數據（n=9）

4.樣品含量測定

分別精密稱定大黃藥材粉末0.5g，共3 份，按“2.1.3 大黃樣品制備成樣品溶液”項下的方法，按“2.1.1”項下的色譜條件進樣，通過外標一點法計算沒食子酸和肉桂酸的含量，結果見表4。

表4 大黃含量測定數據

5.討論與總結

采用二極管陣列檢測器，在200 ～400nm 波長下對樣品和混合對照品溶液進行全波長掃描，混合對照品沒食子酸和肉桂酸在278nm 波長下共有最佳吸光度，且溶劑峰小，基線平穩，混合對照品的響應值較大，故最終采用278nm 作為本試驗的檢測波長。

本實驗采用甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.2%甲酸溶液、甲醇-0.1%冰醋酸溶液、甲醇-0.2%冰醋酸溶液、甲醇-0.3%冰醋酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液等流動相選擇試驗比較，認為以甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相，梯度洗脫，大黃沒食子酸、肉桂酸分離效果較好，與雜峰達到基線分離。在樣品制備方法考察中，選擇水、甲醇（30%、40%、50%、60%、65%、70%和75%）做對比，當以65%甲醇做溶劑時提取的樣品中肉桂酸和沒食子酸的含量相對較高，因此選用65%甲醇作為最優提取溶劑的體積分數。