GAS6 基因多態性及其血漿水平與昆明地區漢族糖尿病腎臟疾病的相關性

李佳麗，周曉偉，郭偉昌，陳 婕，張 帆，李會芳

（1） 昆明醫科大學第一附屬醫院糖尿病科，云南昆明 650032；2） 朔州市大醫院內分泌科，山西朔州 036000；3） 昆明醫科大學體育部，云南昆明 650500）

近年來，糖尿病已逐漸成為慢性病、多發病[1]。其中，DKD 是最常見的糖尿病微血管并發癥，也是糖尿病患者的主要死因之一[2]。DKD 的發病機制較復雜，主要與血糖長期控制不佳致機體出現的氧化應激有關，T2DM 會使患者出現自身免疫反應及低度慢性的臨床炎性反應，從而導致DKD 的發生與發展[3]。目前，臨床上多用尿微量白蛋白、尿白蛋白肌酐比值等指標早期診斷DKD，但這些指標受影響的因素較多[4]，因此，尋找診斷DKD 的新型生物標志物對于早期預防疾病有重要的意義。

研究表明[5]，DKD 患者普遍存在炎性細胞浸潤、炎癥因子水平上升等表現。GAS6 是屬于維生素K 依賴蛋白家族的一種分泌蛋白，參與炎癥反應過程[6]。Hung 等[7]證實在新發糖尿病患者中，血漿GAS6 水平與血糖水平、炎癥、內皮功能異常標志物呈負相關。GAS6 不僅與糖尿病發生相關，更有研究證實[8]，GAS6 在DKD 的初始階段也發揮重要作用。GAS6 可與Axl（受體酪氨酸激酶） 結合，促進P27 的表達，P27 是細胞周期的調節因子之一，能誘導G1 期細胞周期停滯，導致腎小球系膜細胞肥大，促使DKD 發生、發展[9]。Arai 等[10]在GAS6 基因敲除小鼠體內發現腎小球的肥大程度有所減輕。Yanagita 等[11]的研究明確，華法林可抑制GAS6 及其受體Axl 的表達，從而減輕腎小球系膜細胞的肥大并改善腎小球的超濾狀態，從而抑制蛋白尿的產生。魯偉等[12]通過比較微量白蛋白尿的T2DM 患者、正常白蛋白尿的T2DM 患者以及健康者的血漿GAS6 水平，發現微量白蛋白尿組血漿GAS6 水平高于正常白蛋白尿組及健康者，差異具有統計學意義，且血漿GAS6 水平與24 h 尿微量白蛋白及HbA1c 水平均呈正相關，而正常白蛋白尿組與健康者的血漿GAS6 水平無統計學差異。在聶明明等[13]的研究中，DKD 組血漿GAS6 水平與總膽紅素（TBIL） 水平、間接膽紅素（IBIL） 水平均高于對照組，差異有統計學意義，提示GAS6 水平與DKD 的發生有關。這一系列相關研究提示，GAS6 在DKD 的發生中起到重要作用。本研究旨在探討GAS6 基因多態性及其血漿水平與昆明地區漢族人群糖尿病腎臟疾病的發生、發展是否具有相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取血糖正常的NC 組成員186例，其中女85例，男101例，均為在昆明醫科大學第一附屬醫院體檢中心體檢過的健康對照者，年齡（51.90±5.27） 歲，空腹血糖≤5.6 mmol/L；T2DM 組由225例2017年9月至2018年1月在昆明醫科大學第一附屬醫院就診的2 型糖尿病患者組成，女110例，男115例，均符合1999年WHO 制定的糖尿病診斷標準，且臨床未診斷為DKD，年齡均在40 歲至55 歲之間；選取在昆明醫科大學第一附屬醫院確診為糖尿病腎臟疾病（DKD 組） 患者127例，其中男63例，女64例，納入標準：符合單純2 型糖尿病組（T2DM 組） 納入標準且尿白蛋白肌酐比值＞30 mg/g 或24 h 尿白蛋白排泄率＞30 mg/24 h，并排除其他可能導致尿白蛋白排泄增加的原因和腎臟疾病，年齡均在40～55 歲。研究對象均已知情同意。

1.2 研究方法

使用DNA 抽提試劑盒提取所有樣本的DNA，并按文獻報道合成引物。

單核苷酸多態性（rs8191974），上游序列（5’-TTGAGCGCACCTTGCGTGTG-3’），下游序列（5'-ACTGTGAGCTGGGAGTTGCC-3’）。

PCR 反應體系：1 μL DNA 模板，上下游引物共2 μL，2X Tap PCR Master Mix 12.5 μL，加dH2O 9.5 μL至總體積25 μL，進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增：預變性處理，95℃5 min，單循環；變性處理30 s，55℃；退火處理30 s；延伸處理72℃40 s；終末延伸處理7 min，整體35 個循環。最后由上海生物工程有限公司進行Sanger 測序，測定所有樣本GAS6 基因rs8191974 位點的基因多態性。ELISA 法測定血漿Gas6 含量。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 三組間臨床指標和GAS6 水平比較

DKD 組的SBP 和TG 均高于NC 組和T2DM 組（P＜0.017），差異有統計學意義；DKD 組的病程、BMI、DBP、TC、LDL、FBG 均高于NC 組，但是HDL 要低于NC 組，差異有統計學意義（P＜0.017）；DKD 組UACR 和HbA1c 水 平 均 高 于T2DM 組，差異有統計學意義（P＜0.017）；T2DM組病程、BMI、SBP、DBP、TG、LDL、FBG 均要比NC 組組，HDL 水平比NC 組低，差異有統計學意義（P＜0.017）；DKD 組及T2DM 組的GAS6 水平均低于NC 組，差異均有統計學意義（P＜0.017）；而GAS6 水平在DKD 組與T2DM 組間的差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 三組的GAS6 水平及各項指標的比較（） （1）Tab.1 Comparison of GAS6 levels and clinical indexes among the three groups （） （1）

表1 三組的GAS6 水平及各項指標的比較（） （1）Tab.1 Comparison of GAS6 levels and clinical indexes among the three groups （） （1）

與NC 組比較，*P ＜0.05；與T2DM 組比較，△P ＜0.05。

表1 三組的GAS6 水平及各項指標的比較（） （2）Tab.1 Comparison of GAS6 levels and clinical indexes among the three groups （） （2）

表1 三組的GAS6 水平及各項指標的比較（） （2）Tab.1 Comparison of GAS6 levels and clinical indexes among the three groups （） （2）

與NC 組比較，*P ＜0.05；與T2DM 組比較，△P ＜0.05。

表1 三組的GAS6 水平及各項指標的比較（） （3）Tab.1 Comparison of GAS6 levels and clinical indexes among the three groups （） （3）

表1 三組的GAS6 水平及各項指標的比較（） （3）Tab.1 Comparison of GAS6 levels and clinical indexes among the three groups （） （3）

與NC 組比較，*P ＜0.05；與T2DM 組比較，△P ＜0.05。

2.2 各組間GAS6 基因rs8191974 位點基因型和等位基因頻率比較

GAS6 基因rs8191974 位點多態性測序圖，箭頭所示基因型分別為GG、GA、AA（見圖1～圖3）。

2.3 各組樣本的Hardy-Weinberg 平衡檢驗

各組樣本的GAS6 基因rs8191974 位點基因型頻率均與Hardy-Weinberg 遺傳定律一致（P＞0.05）。其中，G、A 等位基因頻率分別為0.78、0.22，見表2。

2.4 各組間GAS6 基因rs8191974 位點基因型頻率比較

用R×C 表χ2檢驗比較三組間GAS6 基因rs8191974 位點基因型頻率，有統計學差異（χ2=12.122，P=0.016）。再拆分為2×C 表做χ2檢驗，最后進行兩兩比較，α’=0.05/3=0.017。兩兩比較結果顯示，T2DM 組的GA、AA 基因型頻率低于NC 組，GG 基因型頻率卻比NC 組高，存在統計學差異（χ2=10.779，P=0.005）；DKD組與NC 組及T2DM 組的基因型頻率均無統計學差異（χ2=25.180，P=0.075；χ2=0.805，P=0.669），見表3、表4。

2.5 各組間GAS6 基因rs8191974 位點等位基因頻率比較

用R×C 表χ2檢驗將各組rs8191974 位點的等位基因頻率對比，差異顯著（χ2=11.633，P=0.003）。進一步拆分為2×C 表做χ2檢驗進行兩兩比較，α’=0.05/3=0.017。結果顯示，NC 組的A 等位基因頻率要大于T2DM 組，而G 等位基因頻率要小于T2DM 組，差異顯著（χ2=10.701，P=0.001）；DKD 組與NC 組、T2DM 組間的等位基因頻率的差異均不顯著（χ2=4.994，P=0.025；χ2=0.327，P=0.567），見表5、表6。

2.6 糖尿病腎臟疾病相關因素的Logistic 回歸分析

將糖尿病腎臟疾病與否定為因變量（未診斷=0，診斷=1），自變量包含性別（男性=1，女性=2）、年齡、T2DM 病程、HBP 病程、吸煙史（無=0，有=1）、飲 酒 史（無=0，有=1）、BMI、SBP、DBP、TC、TG、LDL、HDL、FBG、GAS6基因rs8191974 基因型（GG=1，GA=2，AA=3），行Logistic 回歸分析后發現HBP 病程、SBP 和FBG可能是糖尿病腎臟疾病發生的危險因素，但是GAS6 基因rs8191974 多態性及其血漿水平可能與糖尿病腎臟疾病的發生無相關性，見表7。

圖1 GG 基因型Fig.1 GG genotype

圖2 GA 基因型Fig.2 GA genotype

圖3 AA 基因型Fig.3 A genotype

表2 各組樣本的Hardy-Weinberg 平衡檢驗［n（%）］Tab.2 He Hardy-Weinberg blance test in samples from the three groups ［n（%）］

表3 rs8191974 位點基因型頻率比較［n（%）］Tab.3 Cmparisons of genotype frequency of rs8191974 ［n（%）］

表4 rs8191974 位點基因型頻率的兩兩比較Tab.4 Pairwise comparisons of genotype frequency of rs8191974 locus

表5 rs8191974 位點等位基因頻率的比較［n（%）］Tab.5 Comparisons of allele frequency of rs8191974 ［n（%）］

表6 rs8191974 位點等位基因頻率的兩兩比較Tab.6 Pairwise comparison of allele frequency of rs8191974

表7 相關危險因素的Logistic 回歸分析Tab.7 Logistic regression analysis of the risk factors

3 討論

糖尿病腎臟疾病是常見的糖尿病慢性并發癥，表現為腎小球濾過率減小以及持續白蛋白尿，病情早期還可能會出現腎臟高濾過、腎小球肥大以及系膜細胞增殖等變化。已有研究明確，GAS6 來自小鼠腎小球系膜細胞，是一種生長因子。它能作為內源性的有絲分裂原，引起系膜細胞的大規模增殖[14]。Naga 等[8]的研究發現，在鏈脲霉素誘導的糖尿病大鼠體內，腎小球內皮細胞及系膜細胞GAS6及其Axl 表達量明顯增加。而GAS6 及其Axl 表達量的增加，會通過Akt/mTOR 途徑上調P27 的表達，P27 是細胞周期的調節因子之一，能誘導G1期細胞周期停滯，最終引起腎小球肥大[9]。若GAS6 基因被敲除，小鼠Akt 活性則減低，進而減輕腎小球肥大程度[10]。Yanagita 等[11]的研究明確，華法林可抑制GAS6 及其受體Axl 的表達，從而減輕腎小球系膜細胞的肥大并改善腎小球的超濾狀態，從而抑制蛋白尿的產生。這一系列相關研究提示，GAS6/Axl 信號傳導通路在DKD 發生中起到重要作用，若抑制該信號通路，就能夠延緩糖尿病腎臟疾病的進展，從而改善病人生活質量。

本研究發現，DKD 組、NC 組及T2DM 組相比，GAS6 基因rs8191974 位點GG、GA 及AA 基因型頻率的分布無統計學差異（χ2=5.180，P=0.075；χ2=0.805，P=0.669），并且等位基因頻率在各組間也無統計學差異（χ2=4.994，P=0.025；χ2=0.327，P=0.567），所得研究結果與Erkoc 等[15]相同，推測GAS6 rs8191974 位點基因多態性與DKD 可能不存在相關性。Li 等[16]研究GAS6 的血漿濃度會與糖尿病及糖尿病腎臟疾病嚴重程度平行，從而推測出血漿中GAS6 的含量也許與蛋白尿的產生負相關，并提出在早期診斷DKD 時，GAS6 可能是非侵入性生物標志物較好的選擇，而Erek-Toprak 等[17]推測血漿GAS6 含量與T2DM 患者尿白蛋白水平呈正相關關系，提出較高水平的血漿GAS6 含量可能會使糖尿病腎臟疾病風險有不同程度的增加。本研究結果顯示，T2DM 組及DKD 組血漿GAS6 水平均低于NC 組，差異有統計學意義（P＜0.05），但是這兩組間的血漿GAS6 水平不存在顯著性差異，由此推測出血漿GAS6 水平可能與T2DM 的發生有關而與DKD 的發生無關。而這與Li[8]和Erek-Toprak 等[9]的結果不一致，可能是遺傳異質性、地域差異以及種族差異帶來的影響。

在本研究中，昆明地區的漢族人群中，GAS6基因rs8191974 位點基因多態性及其血漿水平與糖尿病腎臟疾病可能不存在相關性，也可能與樣本量較小，差異性難以顯現有關，有待后續擴大樣本量進一步深入研究。