熒光PCR-探針熔解曲線法在缺失型α-地中海貧血快速診斷中的應用

李戀湘 肖奇志 張素粉 吳洪秋

[摘要]目的 探討熒光PCR-探針熔解曲線法（PMCA）在缺失型α-地中海貧血（簡稱“α-地貧”）快速診斷中的應用。方法 收集2019年10～12月珠海市婦幼保健院2261份血樣本和35份羊水樣本。通過雙盲法，采用PMCA和單管多重PCR技術（gap-PCR）同時對上述2296份臨床樣本進行3種常見缺失型α-地貧基因檢測，結果不符樣本用DNA測序技術以確認。結果 2296份臨床樣本中，除PMCA檢測出1例未知突變基因之外，其余與gap-PCR檢測結果一致，兩者符合率為99.9%，此例經DNA測序顯示在探針覆蓋區域發生了單個堿基突變（A>G）。結論 PMCA技術能快速準確檢測3種常見缺失型α-地貧基因，可作為gap-PCR技術的替代或驗證方法，也可用于大規模人群篩查及產前診斷。

[關鍵詞]探針;熔解曲線;α-地中海貧血;多重聚合酶鏈反應

[中圖分類號] R714.55? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）5（c）-0024-04

Application of fluorescence PCR-probe melting curve analysis in the rapid diagnosis of deletion α-thalassemia

LI Lian-xiang? ?XIAO Qi-zhi? ?ZHANG Su-fen? ?WU Hong-qiu

Department of Clinical Laboratory， Zhuhai Municipal Maternity and Child Healthcare Hospital， Guangdong Province， Zhuhai? ?519001， China

[Abstract] Objective To explore the application of fluorescence PCR-probe melting curve analysis （PMCA） in the rapid diagnosis of deletion α-thalassemia. Methods A total of 2261 blood samples and 35 amniotic fluid samples were collected in Zhuhai Municipal Maternity and Child Healthcare Hospital from October to December 2019. Through double-blind method， PMCA and single-tube multiplex PCR （gap-PCR） were used to detect three common deletion α-thalassemia genes in these 2296 clinical samples. The samples inconsistent with results were confirmed by DNA sequencing analysis. Results In these 2296 samples， except for one unknown mutation gene detected by PMCA in one sample， the results of PMCA in others were consistent with those of gap-PCR， with a coincidence rate of 99.9%. DNA sequencing of the only inconsistent sample showed that a single base mutation （A>G） occurred in the probe coverage area. Conclusion PMCA can quickly and accurately detect three common deletion α-thalassemia genes， which can be used as an alternative or verification method of gap-PCR technology， as well as for large-scale population screening and prenatal diagnosis.

[Key words] Probe; Melting curve; α-thalassaemia; Multiplex polymerase chain reaction

α-地中海貧血（a-thalassemia），簡稱α-地貧，是人類最常見的常染色體隱性遺傳病之一，曾譯為甲型地中海貧血或α-珠蛋白基因生成障礙性貧血，于1955年由Rigas首先報道，其病因是由于α-珠蛋白基因缺陷，使α-珠蛋白肽鏈的合成受到部分或完全抑制而引起的遺傳性溶血性貧血[1]。廣東省α-地貧發病率達8.53%[2]，珠海市發病率為8.91%[3]。α-地貧分子缺陷主要為α-珠蛋白基因大片段缺失（缺失型，-α），少數為α-珠蛋白基因點突變（非缺失型，αT），最常見的-α基因有三種，即東南亞缺失（--SEA/）、右側缺失（-α3.7/）、左側缺失（-α4.2/）[1]。靜止型或輕型α-地貧（缺失1個或2個α-基因）表現為無癥狀攜帶者;中間型α-地貧（缺失3個α-基因）的臨床表現較為嚴重，會有輕、中度貧血，黃疸或肝脾腫大等癥狀[4];重型α-地貧（4個α-基因全缺）則可致宮內胎死或胎兒出生前后死亡，甚至導致嚴重產科并發癥[5]。由于目前該病尚無理想的治療方法，通過產前基因診斷選擇性地淘汰中、重型α-地貧胎兒是控制該病發生的首要途徑[1]。

根據原廣東省衛生廳2006年頒布的《地中海貧血產前診斷技術規范》要求產前診斷地貧基因需用兩種方法進行驗證，確保準確性。目前來看，國內大多采用單管多重聚合酶鏈反應（single-tube multiplex polymerase chain reaction，gap-PCR）檢測-α基因，此法成熟、準確率高，在我市也運用了10余年[6]。本研究主要探討一種基于實時熒光PCR的探針熔解曲線法（probe melting curve analysis，PMCA），通過盲法，用其與gap-PCR同時進行檢測-α基因，并以DNA測序分析為標準，評估PMCA檢測-α基因的準確性、適用性，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2019年10～12月到珠海市婦幼保健院做α-地貧基因檢測的2296例樣本，其中靜脈血樣本2261例，羊水樣本35例[孕齡（19.5±1.9）周]，測試前均與受試者簽署了知情同意書，并經相關醫學倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑

全自動核酸提取儀（廈門致善Lab-Aid824）;熒光PCR儀（上海宏石SLAN-96S）;擴增儀（珠海黑馬Hema9600）;電泳儀（北京六一DYY-8C）;核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統（珠海黑馬GSG-2000）。DNA抽提試劑盒、PMCA試劑盒由廈門致善生物科技有限公司（醫療器械注冊證號：國械注準20173403211）提供;gap-PCR試劑盒由深圳亞能生物技術有限公司（醫療器械注冊證號：國械注準20193401915）提供。

1.3方法

1.3.1標本處理? 靜脈血樣本均采用乙二胺四乙酸三鉀（EDTA-K3）抗凝，羊水標本無須特殊處理。

1.3.2 DNA抽提和質量鑒定? 運用全自動磁珠抽提法。采用NanodropR超微量紫外分光光度計于260、280 nm處測定吸光度（A）值以鑒定DNA純度和濃度。在A260/A280比值滿足1.60～1.80的條件下，將待檢的DNA樣品用超純水稀釋至20 ng/μl。

1.3.3 -α基因檢測? 采取雙盲方式，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，PMCA檢測簡要過程如下。將預先稀釋好的待測DNA各加5 μl到含PCR反應液的A、B管中，短暫離心后轉至熒光PCR儀進行PCR擴增和熔解曲線分析。PCR循環參數為：預先50℃ 2 min去除擴增產物污染后[尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）]處理，95℃預變性10 min后，接著進行2次PCR循環。第1次和第2次PCR循環參數分別為：95℃ 30 s、70℃ 30 s（每個循環下降1℃）和76℃ 45 s（10個循環）和95℃ 30 s、35℃ 3 min和76℃ 45 s（50個循環）。擴增完畢后，即進行熔解曲線分析。首先95℃變性1 min、35℃退火3 min，然后以0.4℃/s的速度從40℃升溫至85℃，同時采集熒光5-羧基熒光素（5-carboxyfluorescein，FAM）、5-羧基-X-羅丹明琥珀酰亞胺酯（5-carboxyl-x-rhodamine succinimide，ROX）通道信號，從而可得到PCR產物熔解曲線。對所有標本同時進行gap-PCR檢測。DNA測序分析由廈門致善生物科技有限公司完成。

1.4統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示。

2結果

2.1 PMCA檢測結果

嚴格按照說明書進行結果判讀。A管FAM（A-FAM）通道檢測內控基因，B管FAM（B-FAM）通道檢測--SEA/，A管ROX（A-ROX）通道檢測-α3.7/，B管ROX（B-ROX）通道檢測-α4.2/，有1例在B-FAM通道檢測出--SEA/，而在B-ROX熔解曲線圖中可見一峰與野生型峰熔點差（ΔTm）為5.7℃，超出判讀范圍（4.6±0.5）℃，為一“未知突變”，該例及有代表性的結果見圖1（封四）。

2.2 PMCA與gap-PCR檢測結果的比較

結合2296例樣本αT基因結果，根據缺失情況進行統計，其中攜帶有三種常見-α基因的樣本有701例，非攜帶樣本有1595例。除1例用gap-PCR檢出--SEA/αα而用PMCA檢出--SEA/αα合并一未知突變外，其余檢測結果完全一致，兩者符合率為99.9%（表1）。

2.3 DNA測序復檢

對該例樣本進行DNA測序分析，檢測到--SEA/αα雜合子，同時對PMCA的B-ROX探針覆蓋的基因區段測序，檢測到單個堿基突變，即A>G（表2），該突變應為熔解曲線圖所示的“未知突變峰”。

3討論

目前，PMCA已運用于非缺失型α-地貧及β-地貧的基因診斷，該法快速簡便、低成本、準確率高，適用于地貧的大規模篩查及產前基因診斷[7-8]，但運用于缺失型α-地貧基因診斷的臨床實驗報道極少見。本研究中PMCA是先運用引物擴增人α-珠蛋白基因和內控基因，再利用熒光標記探針與不同的靶序列雜交形成不同的雙鏈雜交體，在溫度由低到高的變化過程中發生解鏈，同時伴隨著熒光探針發出的熒光信號強度的變化，在某一溫度熒光強度變化達到最大值即為該雙鏈雜交體的熔點溫度（Tm）。不同的雙鏈雜交體其穩定性不同，Tm值亦不同，從而可呈現出不同的熔解峰以區分不同的靶序列，通過計算不同熔解峰的Tm值與對應野生峰Tm值之差（ΔTm）來判讀結果。本研究發現，PMCA和gap-PCR檢測方法相比，優勢主要有：其一，全程閉管操作，僅需用一臺熒光PCR儀4 h內就能完成測試，快速簡便，而gap-PCR不僅需多臺檢測設備占用大量實驗室空間，而且擴增完后還需跑凝膠電泳，操作相對繁瑣且耗時長，增加開蓋污染及人工出錯的風險;其二，結果判讀直觀且客觀，gap-PCR則需借助凝膠成像儀人工判讀結果，存在一定的主觀性;其三，試劑成本低，單個樣本成本十幾元，gap-PCR則在六十元左右;此外，PMCA檢測體系中還包含了內控，有效監測了擴增效果，還可提示是否漏加樣本。值得一提的是，gap-PCR采用單管擴增操作，由于a-珠蛋白基因簇中α1和α2-基因有高同源性及高G+C特點，當擴增-α3.7/基因片段時重復性欠佳[6]，而PMCA檢測-α3.7/有其特定檢測通道，所受影響較少。而且，本研究通過盲法測試，兩種方法檢測結果基本符合，并且PMCA能在其檢測覆蓋區域內準確檢出未知突變，說明PMCA準確率高，與之前報道[7-8]一致，故可作為gap-PCR的替代或驗證方法。此外，近年來有報道[9-10]運用多重連接依賴性探針擴增技術、高通量測序技術診斷α-地貧基因，方法先進且結果精確度高，可以發現罕見類型地貧，甄別母血污染源產前診斷樣本，但同時也存在成本高、技術要求高、儀器設備配置高等問題，相比之下，PMCA更適合普遍推廣用于臨床和基層實驗室。

本研究發現PMCA也存在一些不足：當DNA濃度不合適或純度不高時，容易造成曲線不平滑難以判讀;當在探針覆蓋區域的基因片段發生了未知基因突變時，可能出現異常峰，從而給判讀造成一定困擾;其次目前還僅限于檢測三種常見-α基因。本研究還發現，當判讀-α3.7/--SEA或-α4.2/--SEA基因型時，由于--SEA/缺失了一對染色體中的一條染色體上全部的α1-和α2-基因，而-α3.7/或-α4.2/缺失發生在另一條染色體上部分的α1和α2-基因上，即-α3.7/缺失了α1-基因的5′端和α2-基因的3′端，-α4.2/缺失了α2-基因[1]，--SEA/基因片段超出了PMCA檢測體系中A-ROX或B-ROX探針檢測區域，因此，顯示B-FAM曲線圖上有--SEA/缺失型峰和野生型峰，而在A-ROX或B-ROX曲線圖上僅有-α3.7/或-α4.2/缺失型峰，無野生型峰，這需要特別注意，不要遺漏而錯判為-α3.7/或-α4.2/純合子，最好結合αT基因型、β-地貧基因型及血液學表型綜合分析，以提高準確性。另外，本研究中PMCA檢測到1例--SEA/αα合并未知突變基因，經DNA測序確認的單堿基突變，可能由于SNP多態性所致，同時結合該例臨床表現來看，有明顯的小細胞低色素性貧血，未見異常血紅蛋白帶，綜合分析其確與--SEA/αα基因型相當，也與gap-PCR檢測結果一致。

近年來，地貧因其具有致死性、致殘性、可導致出生死亡或缺陷而引起國內外廣泛關注[11]，全球每年約有70 000例地貧患兒出生[12]，國內外治療地貧的方法有限，長期輸血治療，造成嚴重的家庭、社會經濟負擔，甚至嚴重的精神負擔[13-14]。作為高發地區的珠海市，2013年已將地中海貧血基因檢測列為孕前產前免費項目，結婚夫婦雙方先進行孕前及產前的篩查，必要時做產前基因診斷，從而降低中、重型地貧患兒的出生率。目前本實驗室已建立應用RDB聯合PMCA對非缺失型α-地貧及β-地貧進行產前基因診斷的雙重體系，大大提高了準確率同時還防止漏診及誤診[15]，本研究中經PMCA檢測35例羊水樣本與gap-PCR結果完全吻合，且結果準確，其還可對可能存在少量母體污染源的羊水樣本具有更明顯的提示作用[15]，所以PMCA可作為另一種驗證方法進行缺失型α-地貧的產前基因診斷，也可以嘗試展開應用gap-PCR聯合PMCA對缺失型α-地貧的產前基因診斷。

對于下一代測序技術高速發展的今天，對α珠蛋白基因直接進行序列分析的檢測方法也是可行的，但綜合成本效益及本實驗室規模考慮，目前更傾向于選擇一種快速、準確、簡便、高效的方法，因為經過血液學表型篩選后的每個孕前產前育齡人群都需做α-地貧基因檢測[16]，而PMCA具備對大樣本量篩查的優勢，可先用PMCA對α-地貧基因進行快速篩查，如發現基因型與表型不符，再用gap-PCR及RDB復檢或有必要時做DNA測序，從而盡早得出準確結果，臨床也能及時進行孕前產前指導。

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（收稿日期：2020-02-25? 本文編輯：任秀蘭）

[作者簡介]李戀湘（1982-），女，廣東珠海人，本科，主管技師，主要從事分子遺傳研究