‘農大6號’歐李果實花色苷提取工藝優化及生物活性研究

杜靈敏 付鴻博 杜俊杰 王鵬飛 穆霄鵬 張建成

摘要：為研究‘農大6號歐李果實花色苷的生物活性，本試驗對其提取工藝進行了優化，并對其抗氧化活性以及抑菌效果進行分析。結果表明，在乙醇體積分數為90%，pH=3.0，料液比為1∶ 7（g∶ mL），超聲時間為30 min條件下，歐李果實花色苷提取量最高，為0.112 mg/g;歐李果實精制花色苷的DPPH·自由基清除力、FRAP還原力、·OH自由基清除力顯著高于粗制花色苷;果實花色苷對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及枯草芽孢桿菌有抑制效果，最小抑菌濃度分別是1 040、260、2 080 μg/mL，60℃以上高溫處理后，花色苷降解速率加快，抑菌效果也會減弱。

關鍵詞：歐李;花色苷;提取;生物活性

中圖分類號：S662.3 ?文獻標識號：A ?文章編號：1001-4942（2020）02-0125-06

Abstract In order to research the bioactivity of anthocyanins in Cerasus humilis variety Nongda 6， the extraction technology was optimized， and their antioxidant activity and bacteriostatic action were analyzed. The results showed that the extraction content of anthocyanins was the most as 0.112 mg/g under ultrasound extraction with 90% ethanol solution at pH=3.0 and solid-to-liquid ratio as 1∶ 7 （g∶ mL） for 30 minutes. The TEAC values of DPPH·radical scavenging ability， FRAP reducing ability， and·OH radical scavenging ability of anthocyanin purification solution of Cerasus humilis were significantly higher than those of the crude extraction solution. The Cerasus humilis anthocyanins had inhibition to E. coli， Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis， and the minimum inhibitory concentrations were 1 040， 260， 2 080 μg/mL， respectively. The degradation could be accelerated and the bacteriostatic effect of anthocyanins decreased after treated at above 60℃.

Keywords Cerasus humilis; Anthocyanins; Extraction; Bioactivity

歐李（Cerasus humilis）為薔薇科櫻桃屬，是我國特有的灌木果樹樹種之一，主要分布于黑龍江、吉林、遼寧等13個省區[1]。其果實富含氨基酸、維生素、有機酸及多種礦質元素，并含有較多的花色苷、黃酮醇、黃烷醇、單寧等多酚物質，是一種具有較高營養價值的水果[2]。花色苷屬于一種水溶性天然色素，安全無毒，具有抗氧化、抗衰老、抗炎、增強視力等功效，是一種潛在的功能性著色劑[3-8]。隨著合成色素的使用受限，各國均致力于開發天然色素以逐漸取代合成色素，因此，如何高效提取花色苷成為研究熱點[9]。

花色苷是極性分子，易溶于乙醇、甲醇等有機溶劑，為防止其在提取過程中降解，提取劑中需加入少量的鹽酸和甲酸，同時，還會采取一些輔助方法提高提取效率。它的主要提取方法包括溶劑提取法、超臨界流體萃取法、酶法提取法、高壓脈沖電場輔助提取法和超聲輔助提取等。溶劑提取法是使用一種或幾種不溶于水的有機溶劑將目標產物選擇性地從水溶性溶液中浸提[10];超臨界流體萃取法作為一種新型的、最先進的物理萃取技術，可通過改變體系溫度或壓力參數實現對目標物的提取和分離[11];酶法提取法可使細胞壁和細胞間質結構發生局部疏松、膨脹等變化，從而增大細胞內有效成分向提取介質中擴散，提高色素提取效率[12，13];高壓脈沖電場輔助提取法是一種新型的非熱加工食品技術，可使自身物質的內外傳質過程加速[14];超聲輔助提取是利用超聲波增強對提取原料的細胞壁和細胞膜的破壞作用，有助于目標產物從細胞器中溶出，從而縮短提取時間、降低能源消耗、提高花色苷提取率，具有操作簡單和過程易控制等特點[15]，因而廣泛應用于花色苷提取過程中。目前，科研人員對花色苷生物活性的研究主要集中在分離純化以及抗氧化活性等方面。

本研究以‘農大6號歐李果實為材料，采用超聲輔助提取花色苷，通過單因素試驗、正交試驗確定最優提取工藝，并對提取得到的花色苷進行抗氧化活性和抑菌作用研究，旨在評價‘農大6號歐李的生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料

供試歐李品種為‘農大6號，于2017年8月采自山西省太谷縣巨鑫試驗基地。

供試大腸桿菌（E. coli）由山西農業大學園藝學院歐李團隊提供;金黃色葡萄球菌（Staph. aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、青霉（Penicillium）、黑曲霉（Aspergillus nige）均購自中國典型培養物保藏中心。

1.2 主要試劑與儀器

無水乙醇、氫氧化鈉和乙酸鈉購自天津市化學試劑三廠，1，1-二苯基-2-苦肼基自由基、30%過氧化氫購自南京化學試劑股份有限公司，硫酸亞鐵、水楊酸購自天津市北辰區方正試劑廠，以上試劑均為分析純。

UV-5200紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器公司產品;JJ224BC型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠產品;SB25-12D超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司產品;HC-2518R高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司產品;RE-2000B旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠產品;SHZ-Ⅲ型循環水真空泵，上海亞榮生化儀器廠產品;DH系列電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司產品。

1.3 花色苷提取工藝

1.3.1 花色苷含量 采用pH示差法測定，參考Lee等[16]的方法稍作修改。取0.025 mol/L氯化鉀-鹽酸緩沖液（pH=1.0）和0.4 mol/L乙酸鈉-鹽酸緩沖液（pH=4.5）各4.5 mL，分別加入0.5 mL提取液，搖勻、平衡15 min，于520、700 nm下測定吸光值，計算花色苷含量C（mg/g）。

式中：A11、A21分別為溶液pH=1.0時520、700 nm下的吸光值，A12、A22分別為溶液pH=4.5時520、700 nm下的吸光值;MW=449.2 g/mol;摩爾消光系數ε=26 900 L/（mol·cm）;DF為稀釋倍數;L為光程（cm）;V為提取液體積（mL）;m為原料質量（g）。

1.3.2 各因素對花色苷含量的影響 在預試驗基礎上，利用超聲輔助提取，選擇酸化乙醇為提取溶劑。對超聲時間、料液比、乙醇體積分數和pH值四個因素進行單因素試驗，超聲時間設10、20#、30、40、50 min 5個水平;料液比設1∶ 5、1∶ 6、1∶ 7、1∶ 8#、1∶ 9（g∶ mL）5個水平;乙醇體積分數設50%、60%、70%、80%、90%#5個水平;pH值設1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 5個水平。其中，當考察其它因素對花色苷含量影響時， “#”標記的因素保持恒定水平試驗。重復3次。

1.3.3 花色苷提取條件的優化 根據單因素試驗結果采用L9（34）正交試驗設計，分別以提取乙醇體積分數（A）、料液比（B）、pH值（C）、超聲時間（D）作為因素考察，并各選取三個水平進行試驗，以確定最優提取條件。

1.4 花色苷制備

稱取一定量的果實，液氮研磨，按照料液比1∶ 7加入體積分數為90%酸化乙醇溶液，超聲提取30 min，10 000×g轉速條件下離心30 min，提取2次，合并上清液得到粗提液，冷凍干燥得到粗制花色苷粉末。粗提液蒸發濃縮后通過AB-8大孔樹脂吸附至飽和后先用蒸餾水洗至流出液為中性，再用乙醇洗脫，當流出液為無色時洗脫完成，收集洗脫液，經冷凍干燥得到精制花色苷粉末。

1.5 花色苷抗氧化能力測定

DPPH·自由基清除率參照文獻[17]方法測定;FRAP還原力參照文獻[18]方法測定;·OH清除率參照文獻[19]方法測定。

1.6 花色苷抑菌能力試驗

1.6.1 敏感性試驗 參照蔣麗施等[20]的方法進行。分別取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉和青霉各0.2 mL的菌液涂布于培養基上，每個培養基放置等距離的3個牛津杯，左右兩邊加0.1 mL花色苷提取液，中間加0.1 mL無菌水作為對照，前3種菌置于28℃、后2種菌置于37℃下培養24 h，觀察抑菌效果。

1.6.2 最小抑菌濃度測定 采用二倍稀釋法，將稀釋的花色苷溶液加入培養基，再將稀釋后的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、青霉接種于不同培養基中， 37℃恒溫培養24 h，以有無抑菌圈作為判斷是否為最小抑菌濃度（MIC）的標準。

1.6.3 溫度處理對花色苷的抑菌效果試驗 根據MIC配制花色苷溶液，分別于25、40、60、80、100℃下處理30 min，加入到對應的菌液混勻，再分別于0、2、4、6、8、12、20 h取樣，測OD600值，計算抑菌率。

1.7 數據統計分析

采用Microsoft Excel 2016和SPSS 20.0軟件進行數據統計、作圖和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 歐李果實花色苷提取工藝

2.1.1 單因素對花色苷含量的影響 由圖1可以看出，花色苷含量隨超聲時間的延長表現為先上升后下降，并于30 min時達到最高值0.052 mg/g;花色苷含量在料液比為1∶ 5～1∶ 9范圍內呈現先下降后略微上升的趨勢，并在比值為1∶ 5時達到最大值0.053 mg/g;花色苷含量隨乙醇體積分數的增加表現為先下降后上升，于乙醇體積分數90%時達到最大值0.064 mg/g;花色苷含量在pH值為3.0時最高，為0.094 mg/g。

2.1.2 歐李果實花色苷提取條件的優化 根據2.1.1中試驗結果，設計正交試驗（表1）。由表2可知，影響歐李花色苷提取量的因素由強到弱依次是：料液比>pH值>超聲時間>乙醇體積分數，最優方案為A3B3C3D3。進一步試驗驗證得到該組合下花色苷的提取量為0.112 mg/g。因此，花色苷最終提取條件為乙醇體積分數90%，料液比1∶ 7（g∶ mL），pH值3.0，超聲時間30 min。方差分析（表3）可知，除超聲時間外，其它三個因素對花色苷提取量均有極顯著影響。

2.2 歐李果實花色苷抗氧化能力

由圖2看出，歐李果實粗制與精制花色苷抗氧化能力（用TEAC值表示）差異顯著。精制處理花色苷清除DPPH·和·OH自由基顯著高于粗制處理42.27%和3.44倍。FRAP還原力精制處理比粗制處理顯著提高56.70%。

2.3 歐李果實花色苷抑菌能力

2.3.1 敏感性試驗結果 圖3A、3B、3C中有明顯的抑菌圈出現，圖3D、3E中沒有抑菌圈出現。說明歐李果實花色苷對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有抑菌效果，而對黑曲霉和青霉沒有抑菌效果。

2.3.2 最小抑菌濃度（MIC） 由表4可知，歐李果實花色苷對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別是1 040、2 080、260 μg/mL，對霉菌無抑制效果。大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌分別是革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陽性菌，說明歐李果實花色苷對細菌有廣泛抑制作用。

2.3.3 溫度處理對花色苷抑菌效果的影響 由圖4可知，不同溫度處理的歐李果實花色苷對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌短時間抑菌效果較明顯， 2 h抑菌率達到最高，但隨著時間的延長逐漸下降，可能是部分花色苷被破壞而失去抑菌作用。在2～20 h之間，80℃和100℃的抑菌效果明顯低于25、40、60℃。說明60℃以上的高溫會降低花色苷的抑菌效果。

3 討論與結論

本研究在單因素分析的基礎上，對‘農大6號歐李果實花色苷的制備進行了優化，得到各因素對花色苷提取的影響由強到弱依次為：料液比>pH值>超聲時間>乙醇體積分數;最優提取工藝為乙醇體積分數90%，pH=3.0，料液比為1∶ 7，超聲時間30 min，在此條件下之制備的花色苷含量為0.112 mg/g。

本研究通過對‘農大6號歐李果實花色苷進行抗氧化試驗得出，精制花色苷的DPPH·、·OH自由基清除力、FRAP還原力顯著高于粗制花色苷。抑菌試驗顯示，果實花色苷對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有抑制效果，相應的最小抑菌濃度分別為1 040、260 μg/mL和2 080 μg/mL。

韓永斌等[21]認為LB培養基pH值為7.0左右時，剛加入的花色苷以二苯基苯并吡喃離子形式存在，抑菌活性最強，但隨著時間的延長花色苷逆轉變為其它形式，抑菌效果減弱。熱處理是最常見的有效殺菌方法，可以延長貨架期，該過程溫度的變化能顯著影響花色苷的熱降解速率[22]。溫度升高可使二苯基苯并吡喃向著無色的甲醇假堿和查爾酮形式轉化，降解速率加快[22-24]。本試驗中，溫度在40℃及以下時，花色苷含量基本無變化，當增加到60℃，花色苷含量略有減小，達到80℃以上時，花色苷含量急劇降低，隨著時間的延長，下降更明顯，因此60℃以上的高溫會降低花色苷抑菌效果。建議歐李食品的加工中，適當增加高溫殺菌時間以達到延長產品保質期的目的。

參 考 文 獻：

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