小檗堿對大鼠高血壓左室肥厚心肌表達miRNA-29b的影響及抑制心肌纖維化的作用機制

鄭穎 李小華 李強 張憶雪 陳漠水

[摘要] 目的 探討小檗堿（BBR）對大鼠高血壓左室肥厚心肌表達miRNA-29b的影響及抑制心肌纖維化的作用機制。 方法 將25只雄性SD大鼠隨機分成假手術組（Sham組，n = 7），模型組（Model組，n = 9）和模型給藥組（Model+BBR組，n = 9）。腹主動脈縮窄法制備大鼠高血壓心肌肥厚模型，術后8周測定各組超聲心動圖、心臟肥大指數，Masson染色檢測心肌組織纖維化，RT-PCR檢測心肌組織miRNA-29b及其靶基因col1α1和col3α1 mRNA表達。 結果 Model組的舒張末期室間隔厚度（IVSd）、舒張末期左室后壁厚度（LVPWd）均厚于Sham組，左室長軸縮短分數（FS）、射血分數（EF）均低于Sham組，差異有統計學意義（P < 0.05）;Model+BBR組的IVSd、LVPWd均薄于Model組，FS、EF均高于Model組，差異有統計學意義（P < 0.05）。Model組的心臟重量顯著重于Sham組，心臟/體重比顯著高于Sham組（P < 0.01）;Model+BBR組的心臟重量輕于Model組，心臟/體重比低于Model組（P < 0.05）。Model組的心肌膠原蛋白體積分數顯著高于Sham組（P < 0.01）;Model+BBR組的心肌膠原蛋白體積分數低于Model組（P < 0.05）。Model組的Col1α1 mRNA和Col3α1 mRNA水平均高于Sham組，miRNA-29b水平低于Sham組（P < 0.05或P < 0.01）;Model+BBR組的Col1α1 mRNA和Col3α1 mRNA水平均低于Model組，miRNA-29b水平高于Model組（P < 0.05）。 結論 BBR可能通過下調miRNA-29b水平及上調其靶基因表達水平，抑制高血壓心肌肥厚模型心肌肥厚和心肌纖維化。

[關鍵詞] 小檗堿;心肌肥厚;心肌纖維化;miRNA-29b

[中圖分類號] R-332? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）05（b）-0019-04

Effect of Berberine on the expression of miRNA-29b in left ventricular hypertrophy and the mechanism of inhibition of myocardial fibrosis

ZHENG Ying? ?LI Xiaohua? ?LI Qiang? ?ZHANG Yixue? ?CHEN Moshui

Department of Cardiology， Haikou Hospital Affiliated to Xiangya Medical College of Central South University? Haikou People′s Hospital， Hainan Province， Haikou? ?570208， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Berberine on expression of miRNA-29b in hypertensive left ventricular hypertrophy myocardial tissue and the mechanism of inhibition for myocardial fibrosis. Methods Male SD rats （n = 25） were randomly divided into sham operation group （sham group， n = 7）， model group （model group， n = 9） and model administration group （model+BBR group， n = 9）. Rat model of hypertensive cardiac hypertrophy was established by abdominal aortic coarctation. The cardiac structure and function were measured by echocardiography. The cardiac hypertrophy index was measured at 8 weeks postoperatively. The changes of myocardial fibrosis were detected by Masson staining. The expression of miRNA-29b and its target genes col1α1 and col3α1 mRNA in myocardial tissue were detected by RT-PCR. Results IVSd and LVPWd in model group were thicker than those in sham group， and FS and EF were lower than those in Sham group （P < 0.05）. IVSd and LVPWd of model+BBR group were thinner than those of model group， and FS and EF were higher than those of model group （P < 0.05）. Heart weight of model group was significantly heavier than that of sham group， and heart/body weight ratio was significantly higher than that of sham group （P < 0.01）. Heart weight of model+BBR group was lighter than that of model group， and the heart/body weight ratio was lower than that of model group （P < 0.05）. The volume fraction of myocardial collagen in model group was significantly higher than that in sham group （P < 0.01）. The volume fraction of myocardial collagen in model+BBR group was lower than that in model group （P < 0.05）. The level of col1α1 mRNA and col3α1 mRNA in model group was higher than those in sham group， and the level of miRNA-29b was lower than that in sham group （P < 0.05 or P < 0.01）. The level of col1α1 mRNA and col3α1 mRNA in model+BBR group was lower than those in model group， and the level of miRNA-29b was higher than that in model group （P < 0.05）. Conclusion Berberine inhibits myocardial hypertrophy and myocardial fibrosis by down-regulating miRNA-29b levels and up-regulating its target gene expression.

[Key words] Berberine; Cardiac hypertrophy; Cardiac fibrosis; miRNA-29b

高血壓所致左室肥厚是心肌梗死、心力衰竭及心血管疾病總死亡率的強預測因子，逆轉左室肥厚和心肌纖維化已成為高血壓治療的潛在策略之一[1]。microRNAs（miRNAs）是一種短鏈非編碼RNA，參與以慢性后負荷增加導致的以心肌肥厚和心肌纖維化為特點的心肌重構[2]。小檗堿（BBR）可有效抑制左室肥厚及心肌纖維化，改善心功能[3]。最近研究提示，BBR可能對miRNA-29b有調控作用，干預心肌纖維化[4]。本研究通過腹主動脈縮窄法建立大鼠高血壓肥厚心肌模型，探討BBR對大鼠高血壓左室肥厚心肌形成過程中心肌纖維化的預防作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性健康SD大鼠25只，體重（200±24）g，SPF級，上海斯萊克實驗動物有限公司提供，生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005。本研究經海口市人民醫院生物醫學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑

鹽酸小檗堿（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號：B139120）;Masson三色染液（珠海貝索生物技術有限公司，貨號：BA4079B）;Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Primer Set（廣州Ribobio公司，貨號：miRQ0000801-1-2）。

1.3 方法

1.3.1 動物造模及分組給藥

SD大鼠按隨機數字表法分成三組：假手術組（Sham組，n = 7）、模型組（Model組，n = 9）和模型給藥組（Model+BBR組，n = 9）。采用腹主動脈縮窄法制備高血壓大鼠模型[5-7]，以10%水合氯醛腹腔麻醉，在雙腎動脈上段0.5 cm處分離腹主動脈，放置直徑為0.6 mm的小圓棒，用4號手術絲線將腹主動脈和小圓棒一起結扎，而后抽出小圓棒使腹主動脈縮窄。Sham組只暴露分離腹主動脈后關腹腔不做任何處理。Model+BBR組大鼠術后1周予灌胃給藥，100 mg/（kg·d）。Sham組及Model組予等量生理鹽水灌胃。術后8周于心尖部分取材，造模成功與否主要參考超聲心動圖，心肌肥大指數，心肌細胞橫徑明顯增大，且有心肌細胞排列紊亂、細胞核增大、畸形等形態學異常，說明造模成功。造模成活大鼠共14只，其中Model組和Model+BBR組各7只。

1.3.2 觀察指標

1.3.2.1 超聲心動圖? 術后8周使用Vevo2100超聲儀探測心臟，于左胸骨旁短切面獲得左心室M型超聲心動圖，測量舒張末期室間隔厚度（IVSd）、舒張末期左室后壁厚度（LVPWd）、左室長軸縮短分數（FS）、射血分數（EF）。

1.3.2.2 心臟肥大指數? 水合氯醛麻醉，腹主動脈取血處死，迅速開胸取出心臟，用冰浴預冷生理鹽水洗凈殘血，濾紙吸干心臟并用天平稱取心臟重量，計算心臟肥大指數=心臟重量/體重×100%。

1.3.2.3 Masson染色檢測心肌間質膠原沉積? 采用Image-pro plus 6.0測量心肌膠原蛋白體積分數，即膠原纖維區所占觀察視野的百分比，每張切片隨機選取5個視野進行測量，計算其均值，作為心肌纖維化指標。

1.3.2.4 RT-PCR檢測心肌組織miRNA-29b及其靶基因的表達? 采用Generay公司高純總RNA快速提取試劑盒提取心肌組織總RNA，按試劑盒說明書操作，使用qRT-PCR Primer Set檢測大鼠miRNA-29b，Bulge-LoopTM miRNA primer 與miRNA 3′端結合，逆轉錄酶催化逆轉錄成cDNA，以U6 snRNA為內參照（引物序列見表1），實時熒光定量PCR儀定量miRNA-29b的表達，熒光定量PCR分析軟件自動進行統計和計算，采用相對定量-△△CT法進行定量，各反應重復3次。

1.4 統計學方法

采用Graphpad Prism 5.0統計軟件進行分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Dunnett-t方法。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠超聲心動圖相關指標比較

Model組的IVSd、LVPWd均厚于Sham組，FS、EF均低于Sham組，差異有統計學意義（P < 0.05）;Model+BBR組的IVSd、LVPWd均薄于Model組，FS、EF均高于Model組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.2 各組大鼠心臟肥大指數相關指標比較

Model組的心臟重量顯著重于Sham組，心臟/體重比顯著高于Sham組（P < 0.01）;Model+BBR組的心臟重量輕于Model組，心臟/體重比低于Model組（P < 0.05）。見表3。

2.3 各組大鼠心肌纖維化情況比較

Masson染色顯示血管和心肌中的膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色。各組大鼠心肌纖維化情況見圖1（封四）。Model組的心肌膠原蛋白體積分數顯著高于Sham組（P < 0.01）;Model+BBR組的心肌膠原蛋白體積分數低于Model組（P < 0.05）。見表4。

2.4 各組大鼠心肌組織miRNA-29b及其靶基因的表達水平比較

Model組的Col1α1 mRNA和Col3α1 mRNA水平均高于Sham組，miRNA-29b水平低于Sham組（P < 0.05或P < 0.01）;Model+BBR組的Col1α1 mRNA和Col3α1 mRNA水平均低于Model組，miRNA-29b水平高于Model組（P < 0.05）。見圖2。

3 討論

以心臟成纖維細胞增殖和細胞外基質沉積為特征的心肌纖維化也已被證明在高血壓引起的心力衰竭的發病機制中起重要作用[8-9]。故延緩或逆轉心肌肥厚和心肌纖維化成為治療高血壓、預防心力衰竭的潛在策略，是近年來高血壓防治領域最具吸引力的治療目標和新熱點。

研究顯示，miRNAs可調節心肌肥大、纖維化，對心肌肥厚的發生、發展有重要影響，是心血管疾病潛在的生物標志物和治療靶點[10-11]。目前已明確其作用機制主要與TGF-β1/Smad信號通路[12]及腎素血管緊張素醛固酮系統介導[13]等密切相關。朱珂等[14]發現，扶正化瘀方抗心肌纖維化的作用可能與其抑制AngⅡ誘導的心臟成纖維細胞增殖，并促進心臟成纖維細胞的凋亡及miRNA-29b-5p表達有關。也有學者認為，miRNA-29b通過激活Notch信號通路抑制心肌纖維化和心肌肥厚，保護心肌細胞發展為心肌梗死[15]。

BBR對壓力誘導的心肌肥厚及心肌損傷有顯著的治療作用[2，16-19]，其作用機制可能與BBR通過上調心肌血管內皮細胞miRNA-29b的表達有關[20]。本實驗發現8周后大鼠IVSd和LVPWd顯著增加，Model+BBR組較Model組心室厚度顯著減輕，提示BBR能夠顯著抑制心肌肥厚;大鼠心臟重量和心體比明顯縮小，Masson染色發現大鼠心肌纖維化程度明顯減輕，提示BBR能抑制大鼠高血壓心肌肥厚和左室纖維化。故本研究采用腹主動脈縮窄法致大鼠心肌肥厚模型提示BBR可以顯著抑制大鼠高血壓心肌肥厚和心肌纖維化。

大鼠高血壓心肌肥厚模型心肌組織miRNA-29b水平顯著降低，miRNA-29b靶基因col1α1和col3α1 mRNA水平明顯增加，而BBR治療后可以顯著上調其心肌組織miRNA-29b水平，降低miRNA-29b靶基因col1α1和col3α1 mRNA水平，提示BBR的抗心肌肥厚和心肌纖維化的機制可能與其對miRNA-29b水平的調節有關。這與Zhu等[20]的研究結果基本相似。

綜上所述，本研究在細胞及動物模型水平上提示了BBR對心肌肥厚的抑制作用，為心肌肥厚與纖維化疾病的治療提供新的治療靶點。

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（收稿日期：2019-09-30? 本文編輯：李亞聰）