蘇云金芽孢桿菌Cry2Aa型殺蟲晶體蛋白的分類與構(gòu)效

施茹玲 郭幼紅

摘 ? 要：通過同源建模法構(gòu)建Cry2Aa型殺蟲晶體蛋白16種成員的活性區(qū)空間結(jié)構(gòu)，基于空間結(jié)構(gòu)將其分為4類，并比較分析。結(jié)果表明，Cry2Aa的DomainⅠ非常保守，幾乎完全重疊;Cry2AaⅡ、Cry2AaⅣ與其他成員的DomainⅡ存在差異;Cry2AaⅡ、Cry2AaⅢ與其他成員的DomainⅢ存在較大差異。研究確定了影響Cry2Aa型殺蟲晶體蛋白結(jié)構(gòu)差異的關(guān)鍵氨基酸及其關(guān)鍵結(jié)構(gòu)片段。

關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢菌;Cry2Aa型殺蟲晶體蛋白;空間構(gòu)象;構(gòu)效

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種革蘭氏陽性孢子細菌，在孢子形成過程中會產(chǎn)生殺蟲晶體（Crystal，Cry）蛋白[1]。Cry2Aa是Cry蛋白中罕見的一種，具有廣泛的特異性，不僅對鱗翅目害蟲產(chǎn)生高毒性，還對雙翅目害蟲具有顯著的殺滅作用，如黑翅伊蚊、尖音庫蚊、稻縱卷葉螟和水稻二化螟[2]。在實驗室條件下，陸續(xù)有Bt產(chǎn)生抗藥性的報道[3]。在許多Cry基因中，Cry2Aa基因具有殺蟲譜廣、殺蟲效率高的特點。經(jīng)Cry2Aa蛋白與BBMV的結(jié)合試驗發(fā)現(xiàn)，昆蟲對Cry2Aa蛋白不容易產(chǎn)生抗性，因此，Cry2Aa應(yīng)用于緩減昆蟲出現(xiàn)抗性是很有價值的[4]。

Cry2Aa類蛋白原毒素被水解后，形成3個有活性的結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域Ⅰ由1～272個殘基組成，螺旋束包含7個螺旋，參與昆蟲中腸細胞膜表面孔洞的形成;結(jié)構(gòu)域Ⅱ由273～473個殘基組成，由3個反向平行的β-折疊組成的β-棱柱結(jié)構(gòu)，參與了昆蟲中腸受體的結(jié)合;結(jié)構(gòu)域Ⅲ由474～633個殘基組成，具有類似凝集素的三明治結(jié)構(gòu)，經(jīng)測定與幼蟲受體結(jié)合和孔的功能有關(guān)[5]。Cry2A蛋白與Cry1A相比，結(jié)構(gòu)和殺蟲機制不同，很有可能成為控制昆蟲產(chǎn)生抗藥性的首選蛋白[6]。

本研究構(gòu)建了Cry2Aa蛋白中16種成員的活性區(qū)空間結(jié)構(gòu)。基于活性區(qū)空間結(jié)構(gòu)差異，對Cry2Aa型伴孢晶體蛋白進行分類，并結(jié)合已有的活性信息探討其構(gòu)效關(guān)系，為今后各種突變體設(shè)計和克隆提供理論基礎(chǔ)，對擴大Cry2Aa型伴孢晶體蛋白的殺蟲譜、增強其殺蟲毒力、延緩害蟲產(chǎn)生抗藥性等具有重要意義。

1 ? ?材料與方法

1.1 ?數(shù)據(jù)庫、服務(wù)器與軟件

美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/GenBank）蛋白質(zhì)與基因序列檢索比對數(shù)據(jù)庫;Protein Data Bank（http：//www.rcsbi.org/pbd/home/home.do）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫;Swiss-Model（http：//swissmodel. expasy.org/）預(yù)測三級結(jié)構(gòu)模型;序列比對服務(wù)器（http：/www. ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）;蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)顯示分析軟件PyMOL。

1.2 ?分析方法

1.2.1 ?Cry2Aa類蛋白活性區(qū)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取Cry2Aa類蛋白的序列后，在Swiss-Model數(shù)據(jù)庫分別提交Cry2Aa類蛋白序列，以已知結(jié)構(gòu)的Cry2Aa（PDB登錄號為1i5p）為模板進行同源建模，模擬出Cry2Aa類蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型。

1.2.2 ?基于二級結(jié)構(gòu)組成特征的Cry2Aa分類

在蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)顯示分析軟件PyMOL中分別打開16個Cry2Aa類殺蟲晶體蛋白成員的三級結(jié)構(gòu)，讀取其二級結(jié)構(gòu)，基于二級結(jié)構(gòu)特征進行分類。

1.2.3 ?不同類型Cry2Aa的結(jié)構(gòu)差異和構(gòu)效關(guān)系

分別選取Cry2Aa1、Cry2Aa3、Cry2Aa7、Cry2Aa14作為Cry2AaⅠ、Cry2AaⅡ、Cry2AaⅢ、Cry2AaⅣ的代表，比較其一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)上的差異。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ?基于二級結(jié)構(gòu)組成特征的Cry2Aa分類

Cry2Aa類蛋白共有16個成員，對各個蛋白質(zhì)進行二級結(jié)構(gòu)特征描述。在此基礎(chǔ)上，將其分為Cry2AaⅠ、Cry2AaⅡ、Cry2AaⅢ、Cry2AaⅣ 4類。

Cry2AaⅠ類包括10個成員：Cry2Aa1、Cry2Aa2、Cry2Aa4、Cry2Aa5、Cry2Aa6、Cry2Aa8、Cry2Aa9、Cry2Aa10、Cry2Aa12、Cry2Aa13。

Cry2AaⅡ類包括2個成員：Cry2Aa3、Cry2Aa11。

Cry2AaⅢ類只有1個成員：Cry2Aa7。

Cry2AaⅣ類包括3個成員：Cry2Aa14、Cry2Aa15、Cry2Aa16。

2.2 ?不同類型Cry2Aa的二級結(jié)構(gòu)分析

比較Cry2AaⅠ、Cry2AaⅡ、Cry2AaⅢ和Cry2AaⅣ 4種蛋白，對各蛋白的二級結(jié)構(gòu)特征進行描述，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DomainⅠ保守性較高，4種蛋白均由α0、α0a、α1、α2、α3、α4、α5、α6及α7螺旋組成。通過與Cry1Aa活性蛋白比較，發(fā)現(xiàn)去除由49個氨基酸殘基組成的N端、α0及α0a，不影響其發(fā)揮穿孔作用[4]。DomainⅡ差異較小，僅Cry2AaⅡ與其他成員在連接β8—β9的Loop上存在差異，Cry2AaⅠ、Cry2AaⅡ和Cry2AaⅣ的二級結(jié)構(gòu)元件完全一致。DomainⅢ也存在差異，Cry2AaⅢ與其他成員存在較大差異，僅存在β12a、β12、β15、β16和β17二級結(jié)構(gòu)元件，且β17比其他成員短，而Cry2AaⅠ、Cry2AaⅡ和Cry2AaⅣ的二級結(jié)構(gòu)元件完全一致。

2.3 ?不同類型Cry2Aa的活性區(qū)空間結(jié)構(gòu)比較分析

2.3.1 ?DomainⅠ的結(jié)構(gòu)比對

比較各類Cry2Aa的DomainⅠ，所有的α螺旋與Loop幾乎完全重疊，如圖1所示。

2.3.2 ?DomainⅡ的結(jié)構(gòu)比對

比較各類Cry2Aa的DomainⅡ，其比對結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，Cry2AaⅠ與Cry2AaⅢ完全重合;Cry2AaⅡ與其他成員的差異主要體現(xiàn)在Loopβ8—β9，表現(xiàn)為卷曲方式不同、長度更長，其原因是Cry2AaⅡ在第408—423位的氨基酸比其他成員多了一個F（苯丙氨酸）和P（脯氨酸）。而Cry2AaⅣ與其他成員的差異主要體現(xiàn)在β3和β7，其走向相同，但構(gòu)象不同，原因是Cry2AaⅣ在第293位的氨基酸存在差異。

2.3.3 ?DomainⅢ的結(jié)構(gòu)比對

比較各類Cry2Aa的DomainⅢ，其比對結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，Cry2AaⅠ與Cry2AaⅣ完全重合;Cry2AaⅡ與其他成員的差異主要體現(xiàn)在β12a，其走向相同，但構(gòu)象不同，原因是Cry2AaⅡ在第480位的氨基酸存在差異。而Cry2AaⅢ與其他成員的差異較大，原因是僅存在β12a、β12、β15、β16和β17二級結(jié)構(gòu)元件。

2.4 ?Cry2Aa型殺蟲晶體蛋白構(gòu)效關(guān)系分析

殺蟲晶體蛋白的毒性水平與毒素的活性濃度有關(guān)，而毒素的活性濃度又取決于蛋白質(zhì)的構(gòu)象和溶解度。

Cry蛋白的DomainⅠ主要負(fù)責(zé)受體結(jié)合后的中腸刷狀緣膜的穿膜以及離子通道的形成;邱林等[7]研究發(fā)現(xiàn)，甜菜夜蛾V-ATPase subunit B為Cry2Aa殺蟲蛋白的功能受體。MONGKON AUDTHO等[8]利用舞毒蛾中腸酶快速將Cry2Aa1結(jié)構(gòu)域Ⅰ切斷，發(fā)現(xiàn)該片段對害蟲不產(chǎn)生毒性。本研究發(fā)現(xiàn)，Cry2Aa的DomainⅠ非常保守，幾乎完全重疊。由此可推斷，Cry2Aa類各蛋白的離子通道的形成作用及與鈣粘蛋白的結(jié)合能力相當(dāng)。

DomainⅡ是一個具有典型的“希臘鑰匙”的結(jié)構(gòu)。研究表明與受體的結(jié)合有關(guān)[9]。Bt蛋白對昆蟲的作用與昆蟲中腸上的受體有關(guān)，不同的蛋白在昆蟲中腸細胞膜上的結(jié)合位點和作用機制不同。Cry2Aa14蛋白（Cry2AaⅣ類）與Cry2Aa1和Cry2Aa2蛋白（Cry2AaⅠ類）的DomainⅡ序列存在氨基酸殘基差異，即W293G，且其結(jié)構(gòu)差異體現(xiàn)在β3和β7，其走向相同，但構(gòu)象不同。RAMESH S HIRE等[10-11]研究發(fā)現(xiàn)，Cry2Aa1、Cry2Aa2與Cry2Aa14對斜紋夜蛾和棉鈴蟲均具有殺蟲活性，然而Cry2Aa14對斜紋夜蛾和棉鈴蟲表現(xiàn)出更高的毒性，且對致倦庫蚊具有殺蟲活性。由此可推測，其β3和β7的構(gòu)象差異可能導(dǎo)致毒性差異。現(xiàn)有的活性信息顯示，Cry2Aa3（Cry2AaⅡ類）對家蠶和舞毒蛾具有殺蟲活性，而其他成員未顯示此活性信息[10]。Cry2Aa3與其他成員的結(jié)構(gòu)差異主要體現(xiàn)在Loopβ8—β9，表現(xiàn)在卷曲方式不同、長度更長，這可能是由于它能識別不同的受體，對不同的害蟲產(chǎn)生不同的毒效。

DomainⅢ可能參與受體之間的相互作用，同時，也與蛋白毒性的大小具有緊密聯(lián)系。Cry2Aa14蛋白（Cry2AaⅣ類）與Cry2Aa1和Cry2Aa2蛋白（Cry2AaⅠ類）相比，雖然DomainⅢ的構(gòu)象完全一致，但是Cry2Aa14蛋白的DomainⅢ序列在V625A存在差異。活性信息顯示，Cry2Aa14對斜紋夜蛾和棉鈴蟲表現(xiàn)出更高的毒性[10]，因此，DomainⅢ單個氨基酸的差異會顯著地影響Cry蛋白的毒性水平。

[參考文獻]

[1]吳洪福，郭淑元，李海濤，等.蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究進展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，40（2）：118-122.

[2]翁綠水，陳 芬，肖國櫻.Cry2Aa基因優(yōu)化設(shè)計及功能驗證[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2013，21（11）：1 261-1 269.

[3]ROH J Y，CHOI J Y，LI M S，et al.Bacillus thuringiensis as a specific， safe， and effective tool for insect pest control[J].Journal of Microbiology and Biotechnology，2007，17（4）：547-559.

[4]朱延明，郜 庭，張 鳳，等.Cry2Aa9m抗蟲基因植物表達載體構(gòu)建及對大豆的遺傳轉(zhuǎn)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，44（1）：1-6.

[5]MORSE R J，YAMAMOTO T，STROUD R M.Structure of Cry2Aa suggests an unexpected receptor binding epitope[J].Structure，2001，9（5）：409-417.

[6]MANIKANDAN R，RAMALAKSHMI A，BALASUBRAMANI V，et al.Characterization and cloning of the Cry2Aa gene from indigenous isolates of Bacillus thuringiensis[J].Molekuliarnaia Biologiia，2015，49（4）：520-526.

[7]邱 林.甜菜夜蛾中腸Cry1Ac/Cry2Aa結(jié)合蛋白的鑒定及功能分析[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[8]AUDTHO M，VALAITIS A P，ALZATE O，et al.Production of chymotrypsin-resistant Bacillus thuringiensis Cry2Aa1 delta-endotoxin by protein engineering[J].Applied Environmental ?Microbiology，1999，65（10）：4 601-4 605.

[9]PANADDA B.Crystal structure of the mosquito-larvicidal toxin cry4Ba and its biological implications[J].Molecular Biology，2005（348）：363-382.

[10]HIRE RAMESH S，MAKDE RAVINDRA D，DONGRE TANAJI K，et al.Expression， purification and characterization of the Cry2Aa14 toxin from Bacillus thuringiensis subsp kenyae[J].Toxicon，2009，54（4）：24-519.

[11]MANIKANDAN R，RAMALAKSHMI A，BALASUBRA-MANI V，et al.Characterization and cloning of the Cry2Aa gene from indigenous isolates of Bacillus thuringiensis[J].Molekuliarnaia Biologiia，2015，49（4）：520-526.