基于網絡藥理學清肺排毒湯治療新冠肺炎的物質基礎及作用機制研究

徐天馥，賀成功，楊 坤*

1安徽中醫藥大學，合肥 230012；2安徽中醫藥大學第二附屬醫院，合肥 230061

2019年12月以來，我國新型冠狀病毒感染肺炎(COVID-19)疫情發展迅速，截至目前確診病例34 546例(其中重癥病例6 101例)，世界衛生組織宣布COVID-19為突發公共衛生事件(PHEIC)[1]。根據國家衛生健康委員會發布《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第五版)》，COVID-19常見的臨床表現為發熱、咳嗽、肌痛、乏力(疲勞)，同時可有消化道癥狀、呼吸困難等癥狀[2]。在影像檢查中根據不同階段，肺部CT呈不同影像特征，其中，重癥者表現為雙肺彌漫性病變，呈“白肺”，常見支氣管充氣征及血管穿行[3]。

祖國醫學認為，大部分病毒感染肺炎屬寒邪引起的外感熱病。《傷寒論》中寒邪以冬季為多，寒邪傷于肌表，由于寒性收引，以及寒為陰邪，易損傷陽氣之故，因此寒邪會阻遏陽氣，導致衛陽被郁，不得宣泄。證見發熱惡寒、頭項強痛、無汗、脈浮等證，亦即傷寒病證的主要表現。若外感寒邪較重，或素體陽氣不足，寒邪可以直中于里，傷及脾腎，形成惡寒、四肢顧冷、戰栗、腹瀉等證，《黃帝內經》中將具有流行性，且傳染性強的“外感熱病”稱為“疫瘍”，在病因上認為“疫瘍”屬于是運氣異常之病。《諸病源候論》表述：“時行病者，是春時應暖而反寒，夏時應熱而反冷，秋時應涼而反熱，冬時應寒而反溫，其非時而有其氣，是以一歲之中，病無長少，率相似者，此則時行之氣也。”《素問·刺法論》中也有類似的論述，其文曰：“余聞五疫之至，皆相染易，無問大小，病狀相似。”一般認為，大多數普通的“外感熱病”也具有傳染性，但其傳染性強弱有程度上的差別，普通“外感熱病”一般不會引起流行。“溫疫”則屬“外感熱病”之中具有強烈傳染性，可引起流行的一類疾病。

國家中醫藥管理局試點開展清肺排毒湯救治COVID-19感染的肺炎患者并取得良好的療效，清肺排毒湯由漢代張仲景所著《傷寒雜病論》中的多個治療寒邪引起的外感熱病的經典方劑優化組合而成。鑒于清肺排毒湯治療COVID-19的作用機制未完全闡明，且中藥復方成分復雜、靶點眾多等原因，本研究通過應用網絡藥理學方法從系統、整體的角度探討中藥復方的已知生物活性成分及作用靶點，進一步根據網絡拓撲分析、分子對接、GO富集分析及KEGG通路富集分析清肺排毒湯治療COVID-19的作用機制，為清肺排毒湯治療COVID-19提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 清肺排毒湯所含主要化合物的收集和篩選

根據中醫藥管理局推薦清肺排毒湯的處方組成，根據《中國藥典》2015版的藥物規范名稱，清肺排毒湯由麻黃Ephedra Herba、炙甘草licorice、苦杏仁Amygdalus Communis Vas、生石膏gypsum production、桂枝Cinnamomi Ramulus、澤瀉Alismaorientale(Sam.)Juz、豬苓Polyporusumbellatus(Pers)Fr、白術AtractylodesmacrocephalaKoidz、茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf、柴胡Radix Bupleuri、黃芩Scutellariae Radix、半夏ArumternatumThunb、生姜ZingiberofficinaleRoscoe、紫菀Asteris Radix et Rhizoma、冬花Farfarae Flos、射干Belamcandae Rhizome、細辛Asari Radix et Rhizoma、山藥Rhizoma Dioscoreae、枳實Aurantii Fructus Immaturus、陳皮Citrusreticulata、藿香Pogostemoncablin(Blanco)Benth組方而成。檢索TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform)http://tcmspw.com/tcmsp.php 數據庫[4]收集清肺排毒湯主要化學成分，按照口服生物利用度(oral bioavail-ability，OB)≥30%，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為條件從上述數據庫中篩選出具有較高活性且可能入血的成分。

1.2 化學成分潛在靶點收集

通過TCMSP數據庫檢索清肺排毒湯候選化合物潛在靶點，并使用Uniport數據庫的UniProKB檢索功能(https://www.uniprot.org/)，通過輸入靶蛋白名稱，限定物種為“Homo sapiens”，剔除非人源靶點，將查詢得到的所有蛋白名稱校正為官方名稱。進而利用網絡拓撲分析軟件Cytoscape3.7.2進行可視化處理，構建“中藥化合物活性成分”網絡。

1.3 確定疾病靶點

基于GeneCards(https://www.genecards.org/)數據庫[5]，以“COVID-19”、“2019-nCoV”、“Novel Coronavirus Pneumonia”為關鍵詞檢索與新型冠狀病毒肺炎相關基因。

1.4 清肺排毒湯作用靶點與COVID-19相關靶點的Venn分析

清肺排毒湯主要化學成分作用靶點與疾病靶點數據集進行Venn分析，得到共同的靶點集，初步挖掘清肺排毒湯治療疾病的作用靶點，以Venn圖的形式展現藥物與疾病交集靶點，并將交集靶點導入STRING數據庫獲取蛋白互作信息，使用Cytoscape軟件構建可視化模型并做網絡拓撲分析，通過蛋白互作網絡篩選核心作用靶點。

1.5 生物分子網絡建立及分析

1.5.1 蛋白質-蛋白質互作關系(PPI)網絡圖構建

Venn分析得到的交集靶點導入STRING數據庫(https://string-db.org/)，限定物種為“Homo sapiens”，設置medium confidence>0.900，獲取蛋白與蛋白間相互作用信息，構建PPI網絡圖，尋找靶點和靶點間作用關系。通過Cytoscape3.7.2軟件插件CentiScaPe2.2[6]對交集的網絡進行拓撲分析，分析內容包括中心性degree值、介度中心性betweenness值、接近中心性closeness、特征向量eigenvector，其中，篩選標準為首先計算出節點中位數對應的數值，高于該數值節點定義為顯著有效化合物和關鍵靶點。

1.5.2 顯著化合物與關鍵靶點分子對接

使用分子對接驗證清肺排毒湯中顯著化合物與關鍵靶點關系的可靠性，并探索其結合模式，通過PDB數據庫(http://www.rcsb.org/pdb/home.do)下載蛋白結構。采用AutoDock Vina[7]軟件進行分子對接。將清肺排毒湯的有效組分對接到對應受體的活性結合位點中，選取最佳構象進行結合模式分析。根據結合自由能值判斷清肺排毒湯有效組分與靶點的結合程度，作為藥物實際作用體內的依據。

1.5.3 富集分析

使用R(Rversion 3.6.1)軟件的ClusterProfiler[8]軟件包對清肺排毒湯活性成分治療COVID-19關鍵靶點進行基因本體Gene Ontology(GO)富集分析和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，得到分析結果以P<0.05、FDR<0.05為指標篩選，并對結果做可視化處理。

2 結果

2.1 清肺排毒湯中候選化合物的篩選

通過TCMSP收集清肺排毒湯的活性成分，設置OB值≥30%、DL值≥0.18為條件，篩選較高活性且可能入血的化合物，其中，陳皮5個、積實22個、山藥16個、細辛8個、射干17個、紫菀19個、生姜5個、姜半夏13個、黃芩36個、柴胡17個、茯苓15個、白術7個、豬苓11個、澤瀉10個、桂枝7個、麻黃23個、杏仁19個、炙甘草92個、冬花22個合計364個，在刪除62個重復化合物后共有302個成分納入候選化合物。

2.2 清肺排毒湯有效成分靶點和COVID-19疾病靶點的預測及相互作用分析

清肺排毒湯包含302個有效化合物作用3 029個作用靶點，在剔除重復靶點后得到148個作用靶點，GeneCards數據庫檢索COVID-19相關靶點362個。經Venn分析，篩選清肺排毒湯潛在作用COVID-19的潛在靶點23個(圖1)。將23個潛在靶點導入SRING數據庫，得到潛在作用靶點的PPI蛋白互作網絡(圖2)，明確靶點和靶點間作用關系。利用CentiScaPe插件對拓撲網絡進行分析，計算拓撲網絡degree值為7.28、betweenness值為304.69、closeness值為1.88E-03，eigenvector值為0.04，篩選高于上述數值的化合物10個(表1)、作用靶點5個(表2)，研究認為上述顯著有效化合物及關鍵靶點起到了治療橋梁作用，利用Cytoscape構建“中藥組方-顯著有效化合物-關鍵靶點”拓撲網絡圖(圖3)。

圖1 清肺排毒湯有效成分靶點和COVID-19相關靶點關系Venn圖

圖2 潛在靶點PPI(蛋白互作)網絡

表1 清肺排毒湯顯著有效化合物

表2 清肺排毒湯關鍵靶點

圖3 清肺排毒湯“中藥組方-顯著有效化合物-關鍵靶點”拓撲網絡圖

2.3 分子對接及結合自由能分析

為驗證清肺排毒湯中顯著有效化合物與關鍵靶點的關系，剖析藥物-靶點間的分子作用機制，本文選擇degree值最高的靶點PTGS2和化合物quercetin進行分子對接(圖4)，原配體結合自由能為-10.2 kcal/mol，新配體結合自由能為-9.5 kcal/mol，結果顯示分子間的結合能力和相互作用能力較強，結合較為緊密。

圖4 Quercetin-PTGS2復合物分子對接模型

2.4 GO富集分析

利用R軟件ClusterProfiler軟件包進行GO富集分析，選取標準為P<0.05、FDR<0.05。分析表明，清肺排毒湯的分子功能調控包括磷酸酶結合、血紅素結合、四吡咯結合、MAP激酶活性、蛋白磷酸酶結合、輔因子結合、抗氧化活性、細胞因子受體結合、過氧化物酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、氧化還原酶活性、細胞因子活性磷酸酪氨酸殘基結合、輔酶結合等28個生物過程，對前20條結果做可視化處理(圖5)。

圖5 清肺排毒湯活性成分治療COVID-19關鍵靶點的GO富集分析

2.5 KEGG通路富集分析

利用R軟件ClusterProfiler軟件包進行KEGG通路富集分析，選取標準為P<0.05、FDR<0.05。KEGG通路富集分析表明，清肺排毒湯可作用IL-17信號通路、肺結核相關信號通路、人巨細胞病毒感染信號通路、Th17細胞分化信號通路、百日咳信號通路、甲型流感信號通路等144個信號通路，進一步對前20條結果做可視化處理(圖6)，KEGG通路富集結果顯示清肺排毒湯可通過調節多個生物過程及通路的協調發揮治療COVID-19的作用。

圖6 清肺排毒湯活性成分治療COVID-19關鍵靶點的KEGG通路富集分析

3 討論

據統計，COVID-19患者臨床表現為咳嗽者占82%，呼吸急促者占31%，說明本次疫病的主要病位在肺部，11%的患者出現了肌肉疼痛，8%的患者出現了頭痛，說明其次病位在衛表[9]。《黃帝內經》認為“外感熱病”是由于感受六淫邪氣，以發熱為主要癥狀的一類疾病。除了熱病、傷寒、溫病之外，還有暑病、瘧、痢等病癥也屬于“外感熱病”之范疇。《素問·熱論》曰：“人之傷于寒也，則為病熱，熱雖甚不死，其兩感于寒而病者，必不免于死。”說明熱病之病名是基于其癥狀而命名的，熱勢高是其陽氣不得泄越所致，汗出而散。《素問·生氣通天論》中論述：“因于寒，欲如運樞，起居如驚，神氣乃浮。”《靈樞·歲露論》中曰：“寒則皮膚急而膝理閉，腠理閉塞而不通，陽氣不得泄越而聚于表，故可見發熱。除了傷寒、溫病之外，寒邪侵襲皮膚、肌肉、筋骨，則會出現皮寒熱、肌寒熱和骨寒熱等證，并可內舍于相合之臟腑而出現相應的變證。”由此可見COVID-19患者臨床變現與中醫中寒邪引起的外感熱病癥狀描述相符。

根據清肺排毒湯組方分析，該方是由“麻杏甘石湯”、“射干麻黃湯”加減化裁而來。麻杏甘石湯主治麻癥發熱脹痛，咳嗽連聲，寒郁毒以致標閉，臨床實踐證明該方對抗流行性病毒有明顯的臨床效果，射干麻黃湯為祛痰劑，具有溫肺化飲，下氣祛痰之功效，治寒痰郁肺結喉證。臨床實踐證明該方對氣管炎癥、哮喘、肺部炎癥等有較好的臨床效果[10]。

本文利用網絡藥理學的研究方法挖掘清肺排毒湯的有效入血成分，構建“活性成分-靶點”交互網絡圖，文章篩選清肺排毒湯的302個活性成分及32個疾病共同作用靶點，根據網絡拓撲分析得到10個顯著有效化合物和5個關鍵靶點，涉及28個顯著生物過程和144條顯著通路，從靶點、信號通路的角度闡釋清肺排毒湯治療COVID-19的作用機制。在10個顯著有效化合物中，槲皮素(quercetin)具有較好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用；木犀草素(luteolin)具有多種藥理活性，如消炎、抗過敏、降尿酸抗腫瘤、抗菌、抗病毒等，臨床主要用于止咳、祛痰、消炎、降尿酸、治療心血管疾病，另有研究表明木犀草素與嚴重急性呼吸道綜合征(SARS)冠狀病毒的S2蛋白結合，抑制病毒進入宿主細胞；柚皮素(naringenin)具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗腫瘤、抗病毒、抗纖維化等多種藥理活性[11]；山奈酚(kaempferol)作為常見的黃酮類化合物具有抗感染抗炎、防癌抗癌等功效；β-谷甾醇(beta-sitosterol)有降膽固醇、止咳、祛痰及抑制腫瘤和修復組織作用，常用于慢性氣管炎等，其抗炎作機理為抑制PGE2、緩激肽、組胺等炎癥介質的活性，同時抑制游離細胞游走[12]。豆甾醇(stigmasterol)又名豆固醇、甾醇，屬植物甾醇，具有較強的生理活性和表面活性，可抗炎、抗氧化、抗癌、降膽固醇等。黃芩在我國藥用歷史悠久，黃芩素(baicalein)和黃芩苷(wogonin)是黃芩發揮功效的主要活性成分，黃芩素和黃芩苷具有抗菌抗病毒、清除氧自由基、抗氧化、解熱、鎮痛、抗炎以及調節免疫功能等功效[13]。異鼠李素(isorhamnetin)具有止咳祛痰作用，川陳皮素(nobiletin)具有抗真菌、抗過敏、抗炎、抗癌、抗血栓、抗癲癇、抗血凝、抗膽堿酯酶等功效。在分子對接實驗中，清肺排毒湯顯著有效成分quercetin與COVID-19治療的關鍵靶點TPGS2對接情況良好，顯示清肺排毒湯所含化合物可能具有潛在的抗COVID-19作用。為進一步闡明清肺排毒湯調控關鍵靶點產生作用，本文在GO富集分析發現5個關鍵靶點，其中，過氧化氫合成酶Ⅰ和Ⅱ(PTGS1和PTGS2)主要調控紅素結合和雙加氧酶活性，參與炎癥反應，增強促炎介質；誘導型一氧化氮合酶(NOS2)可在多種過程中充當生物介質，包括神經傳遞，抗微生物和抗腫瘤活性；過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARG)在多種炎癥上起重要作用，PPARG能夠抑制多種轉錄因子的活性，包括核因子κB(NF-κB)和活化蛋白(activator protein)，從而調節細胞的抗炎反應，并在多種疾病中起保護作用[14]；絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)是MAP激酶家族的一員，參與細胞增殖、分化、轉錄調控和發育等多種過程，并促進炎細胞因子調控激活。通過對關鍵靶點的pathway分析，發現主要通路途徑包括，白細胞介素17(IL-17)相關信號通路，通過相應的受體發出信號激活包括NF-κB，MAPK和C/EBP在內的下游途徑，誘導抗菌肽、細胞因子、趨化因子的表達，在急性和慢性炎癥反應中都起著至關重要的作用[15]；肺結核(tuberculosis)相關通路，結核分枝桿菌通過空氣傳播，經循環系統傳播到身體的其他部位，主要攻擊肺部，干擾吞噬體的成熟、抗原呈遞、細胞凋亡和宿主免疫系統，建立持續性或潛伏性感染；腫瘤壞死因子(TNF)作為一種重要的細胞因子，可以誘導多種細胞內信號通路，包括細胞凋亡和細胞存活以及炎癥和免疫力[16]；絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號通路，由細胞外信號相關激酶如ERK、JUN、P38和ERK5等調控MAPK，涉及多種細胞功能，包括細胞增殖，分化和遷移[17]；Th17細胞分化通路參與細胞外微生物的免疫應答以及自身免疫疾病相關過程，調節IL-17表達，對于免疫和宿主保護至關重要[18]；百日咳相關信號通路(Pertussis)中百日咳桿菌毒素(Ptx)和腺苷酸環化酶毒素(ACT)是百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)的主要蛋白質毒素，可抑制多個下游途徑；人巨細胞病毒相關信號通路(human cytomegalovirus infection)中人巨細胞病毒(HCMV)是一種包膜雙鏈DNA病毒，屬于β-皰疹病毒家族，通過誘導PI3-K/AKT通路的激活[19]。

清肺排毒湯可能通過細胞因子受體結合、抗氧化活性、磷酸酶結合、血紅素結合、MAP激酶活性、蛋白磷酸酶結合、過氧化物酶活性、氧化還原酶活性等生物學功能調控機體代謝、轉錄、炎癥反應等生理過程，另外可能通過IL-17、TNF、MAP、Tuberculosis等相關信號通路發揮抗炎、免疫調節等作用。本研究利用網絡藥理學和生物信息學方法初步驗證了清肺排毒湯的藥理作用機制，從分子水平闡述了清肺排毒湯通過多成分、多靶點、多通路協作，對COVID-19的發生發展產生多方位的干預。