超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定豆芽中6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、2,4-滴和赤霉素

李娜 盧娜 邵輝 劉磊 李輝 張玉婷 郭永澤

摘? ? 要：本研究建立了豆芽中6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、2，4-滴和赤霉素4種植物生長調節劑殘留量的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。樣品中殘留的藥物經甲酸乙腈提取，提取液濃縮、甲醇定容后，采用電噴霧串聯質譜儀在正、負離子多反應監測掃描（MRM）模式下進行測定，基質外標法定量。4種藥物在各自的線性范圍內線性關系良好，相關系數均為0.999。對黃豆芽和綠豆芽中6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、2，4-滴和赤霉素在定量限（LOQ）、5倍LOQ和10倍LOQ 3個添加濃度水平下的回收率進行測定，其平均回收率為81.6% ～94.4%，相對標準偏差為2.4%～6.9%。6-芐基腺嘌呤、2，4-滴、4-氯苯氧乙酸鈉和赤霉素的定量限（S/N≥10）分別為0.005，0.02，0.05和0.05 mg·kg-1。該方法操作簡便，凈化效果好，靈敏度、準確度和精密度均符合多殘留分析的要求，可為豆芽中非法添加物的殘留監控提供技術支持。

關鍵詞：超高效液相色譜-串聯質譜法;豆芽;植物生長調節劑;殘留

中圖分類號：TS255.7? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.04.001

Abstract：? An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric method was developed for the determination of residues of four kinds of plant growth regulators in bean sprout. The target compounds were 6-benzylam inopurine， 4-chlorphenoxyacetic sodium， 2， 4-D and gibberellic acid. The analytes were extracted with acetonitrile containing 1% formic acid solution， and evaporated to remove acetonitrile， then dissolved by methanol， finally detected by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry under multiple reaction monitoring （MRM） mode via positive and negative electrospray ionization. The results showed that the correlation coefficients of the calibration curves for the four compouds were 0.999 in the range of LOQ ～ 20LOQ. The method was validated at three fortification levels （LOQ， 5LOQ and 10LOQ） in soybean sprout and mung bean sprout. The respective mean recoveries were found to be between 81.6% and 94.4%， and the relative standard deviations （RSD） were between 2.4% and 6.9%. The limits of quantification （S/N≥10） of 6-benzylam inopurine， 2， 4-D， 4-chlorphenoxyacetic sodium and gibberellic acid were 0.005， 0.02， 0.05 and 0.05 mg·kg-1 respectively. It was indicated that the method developed in this study was easy， sensitive and good purified. The sensitivity， accuracy and precision of the method were all acceptable. The method can meet the requirements of the multiple residue analysis and can be further applied to investigate the illegitimate additive residues status in bean sprout.

Key words： ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; bean sprout; plant growth regulator; residue

近年來，全國多地曝出“毒豆芽事件”，即在豆芽生產過程中使用6-芐基腺嘌呤（6-BA）、4-氯苯氧乙酸鈉（4-CPA）、2，4-滴（2，4-二氯苯氧乙酸，2，4-D）和赤霉素（GA）等植物生長調節劑促進豆芽快速生長，達到只發芽不生根目的，因此又稱無根豆芽素、豆芽激素。目前，豆芽生產中使用上述物質的安全性尚無定論，但是如果食用過量，肯定會給人的身體健康帶來危害。

我國GB 2760-1996《食品添加劑使用衛生標準》曾允許6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉用于豆芽生產，后又在新版國標GB 2760-2011中撤銷。農業部2015年第11號公告《關于豆芽生產過程中禁止使用6-芐基腺嘌呤等物質的公告》，明確規定不得生產和銷售含有6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、赤霉素等物質的豆芽，否則將依照法律法規予以處理。

目前，豆芽激素的檢測方法有液相色譜法[1-5]、氣相色譜法[1]、液相色譜-串聯質譜法[2，6-15]等，但是已有檢測方法普遍存在單組分測定、前處理步驟繁瑣，不同組分采用不同的前處理方法、存在檢測周期長、耗時耗力等缺陷，已不能滿足檢測機構的要求。因此，亟需建立通過一種多殘留檢測方法，能夠同時測定豆芽中多種植物生長調節劑的方法。

本研究建立了同時測定豆芽中6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、2，4-滴和赤霉素4種植物生長調節劑殘留量的超高效液相色譜-串聯質譜方法，操作簡便、快速，節約成本，可為各食品檢測機構對豆芽中非法添加物的監控提供更加便捷的檢測，對保障豆芽的質量安全具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

AcquityTM UPLC超高效液相色譜儀，Quattro Premier XE三重四極桿質譜儀（配電噴霧離子源），（美國Waters 公司）;旋渦混合器（QL-901，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）;臺式高速離心機（H1650，湘儀離心機儀器有限公司）;旋轉蒸發儀（Laborota 4000 efficient，德國Heidolph）; Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）等。

6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、2，4-滴和赤霉素標準品，純度均不低于99%，購自德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈、甲醇為色譜純，購自美國Fisher公司;水為超純水;甲酸為分析純，購自天津科密歐化學試劑有限公司。

分別稱取各標準品適量，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為100 μg·mL-1的標準儲備液，于4 ℃溫度條件下保存，有效期3個月。分別吸取4種農藥標準儲備液1.25 mL于25 mL容量瓶，用甲醇稀釋并定容，配制成濃度為10 μg·mL-1的混合標準工作液，于4 ℃條件下保存，有效期1個月。

1.2 樣品前處理方法

準確稱取搗碎的試樣5.00 g（精確至0.01 g）于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL乙腈，于旋渦混合器上渦旋2 min，加入0.4 mL甲酸，再渦旋2 min，4 000 r·min-1離心5 min，上清液轉移至100 mL梨形瓶中，于40 ℃條件下旋轉蒸發至約2.5 mL，用甲醇定容至5 mL，過0.22 μm有機濾膜，供液相色譜-串聯質譜儀分析。

1.3 色譜條件

色譜柱：AcquityTM BEH C18柱 （2.1×50 mm，1.7 μm）;流動相：乙腈（A相）-0.1%甲酸水溶液（B相）;梯度洗脫條件見表1。進樣量：10 μL;柱溫：30 ℃。

1.4 質譜條件

電離模式：電噴霧正離子ESI（+）和負離子ESI（-）切換;毛細管電壓：3.0 kv;離子源溫度：110 ℃;脫溶劑氣溫度：380 ℃;脫溶劑氣流量：550 L·h-1;錐孔反吹氣流量：50 L·h-1;多反應監測掃描方式（MRM）;質譜采集參數見表2。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優化

2.1.1 質譜條件? ? 在電噴霧正離子或負離子模式下分別對1 μg·mL-1的單個標準溶液進行全掃描，得到每種化合物的母離子，再進行母離子二級質譜全掃描，選擇信號強度較大的兩個碎片離子為特征離子，并優化最佳錐孔電壓和碰撞能量，最后以多反應監測方式掃描。最優的質譜參數見表2。

2.1.2 液相色譜條件? 本研究選擇通用的Acquity BEH C18柱（2.1×50 mm， 1.7 μm），分別以乙腈和甲醇作為流動相，結果表明，相同條件下乙腈的洗脫能力更強，色譜峰形和響應更好。分別以水、0.1%甲酸和0.1%甲酸（含5 mmol·L-1乙酸銨）為流動相水相，結果表明，0.1%甲酸效果最好，加乙酸銨后負離子的響應并未提高，反而降低。因此，本研究以乙腈-0.1%甲酸為流動相。

采用梯度洗脫，研究4種化合物的最佳分離條件。經過反復試驗，確定最佳的梯度洗脫條件：在0.2 mL·min-1的流速下，0～3 min，乙腈從10%勻速變化至90%;3～4 min，乙腈保持90%，4～5 min，乙腈保持10%，如表1所示。4種化合物能夠完全分離，且峰形良好，整個分析過程在5 min之內即可完成。LOQ濃度水平豆芽加標樣品中4種化合物的總離子流圖和MRM色譜圖見圖1和圖2。

2.2 定容溶液的選擇

本研究比較了乙腈、甲醇及不同比例的甲醇-水混合溶液作為定容溶液的溶解效果。結果表明，6-芐基腺嘌呤用甲醇溶解比乙腈效果好，其他3種化合物無明顯差別。此后又比較（10+90）、（20+80）、（50+50）等不同體積比的甲醇-水溶液的溶解效果，結果表明，當甲醇-水的體積比為（50+50）時，溶解效果最好。因此，確定甲醇-水（50+50， v/v）為定容溶液。

2.3 樣品前處理條件的優化

文獻報道的提取溶劑有酸化乙腈[1，10-15]、酸化甲醇[1-2]、丙酮[1]、稀堿（0.01mol·L-1氫氧化鈉溶液）[1-2，4]、甲醇[3，5]和乙腈[6-7]，凈化方法有MCS柱[10]、HLB柱[13]固相萃取凈化法和QuEChERS方法[11-12，14-15]。

本研究嘗試采用乙腈提取，但酸性化合物4-氯苯氧乙酸鈉、2，4-滴和赤霉素回收率較低;用1%甲酸乙腈提取，3種酸性化合物回收率提高，但6-芐基腺嘌呤回收率降低。最終本研究采用乙腈和1%甲酸乙腈各提取1次，獲得了滿意的回收率，同時減少了有機溶劑用量。

此外，本研究采用提取液濃縮、定容后直接進樣分析的前處理方法，通過增大定容體積、稀釋樣品基質從而達到降低基質干擾的目的，無需固相萃取等步驟，既操作簡便，又節約成本，為各食品檢測機構提供了快速、便捷的檢測方法。

2.4 方法的線性、靈敏度、準確度和精密度

為了消除基質效應，本試驗用基質匹配標準工作溶液繪制標準曲線。以各組分的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，線性方程和相關系數見表3。結果表明，4種化合物在各自的濃度范圍內，線性關系良好，相關系數均為0.999。以信噪比大于3計算方法的檢出限，以信噪比≥10確定方法的定量限，6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、2，4-滴和赤霉素的定量限分別為0.005，0.05，0.02和0.05 mg·kg-1。在LOQ、5LOQ和10LOQ 3個濃度水平做加標回收試驗，每個濃度水平做5個平行樣品，按照上述方法進行前處理和測定。在3個加標濃度水平，4種化合物在黃豆芽和綠豆芽中的平均回收率和相對標準偏差 （RSD） 均列于表3中。4種化合物的平均回收率為81.6% ～94.4%，相對標準偏差為2.4% ～6.9% ，符合多殘留分析的要求。

3 討論與結論

本研究分別對液相色譜和質譜儀器條件、定容溶液的種類和不同配比、樣品處理條件進行了篩選和優化，建立了同時測定豆芽中6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、2，4-滴和赤霉素4種非法添加物殘留的超高效液相色譜-串聯質譜方法，采用基質外標法定量，可有效消除基質效應。

跟現有檢測方法相比，省去了QuEChERS或SPE柱凈化操作，采用乙腈和酸化乙腈各提取1次，提取液只經過一步旋蒸，最后用甲醇稀釋并定容，解決了酸性化合物4-氯苯氧乙酸鈉和2，4-滴提取回收率較低的難題，同時簡化了前處理步驟，提高了檢測效率，節約了檢測成本。該方法操作簡便，凈化效果好，靈敏度、準確度和精密度均符合多殘留檢測技術的要求，可為食品檢測機構對豆芽激素的日常監控提供更加便捷的檢測技術支持。

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