基于特異性對(duì)硫磷單克隆抗體的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析方法建立

呂麗蘭 張婭 鄒承武 甘志勇 吳靜娜 李乾坤 呂玉蓮 易國(guó)強(qiáng) 溫紹聰 何麗珊

摘要：【目的】制備特異性識(shí)別對(duì)硫磷（PA）的單克隆抗體，建立其間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析方法（ic-ELISA），為實(shí)現(xiàn)對(duì)硫磷的農(nóng)殘快檢提供技術(shù)支持。【方法】以化合物4-（二乙氧基硫代磷酸酯基）苯甲酸為半抗原，分別與牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶聯(lián)制備人工抗原，免疫7周齡Balb/c雌性小鼠，取抗血清效價(jià)最高、特異性最優(yōu)小鼠的脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，采用間接酶聯(lián)免疫方法（i-ELISA）及ic-ELISA分別評(píng)價(jià)融合細(xì)胞株的陽(yáng)性和特異性，通過(guò)有限稀釋法篩選穩(wěn)定分泌對(duì)硫磷抗體的單克隆細(xì)胞株。再通過(guò)棋盤(pán)格試驗(yàn)篩選出抗原抗體最佳工作濃度組合建立對(duì)硫磷ic-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并基于對(duì)硫磷單克隆抗體與各結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的交叉反應(yīng)率，評(píng)估ic-ELISA的特異性。采購(gòu)西紅柿樣品進(jìn)行對(duì)硫磷的添加回收試驗(yàn)，運(yùn)用氣相色譜法（GC）驗(yàn)證ic-ELISA的準(zhǔn)確性。【結(jié)果】成功合成對(duì)硫磷人工抗原PA-BSA和PA-OVA，經(jīng)5次免疫后融合小鼠的血清效價(jià)為8×103;通過(guò)有限稀釋法篩選獲得靈敏度高、特異性最強(qiáng)的對(duì)硫磷單克隆細(xì)胞株4F11A10。以2 μg/mL包被抗原PA-OVA、0.25 μg/mL細(xì)胞株4F11A10分泌抗體為最佳抗原抗體工作濃度組合，建立對(duì)硫磷ic-ELISA及其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其半抑制濃度（IC50）為50 ng/mL，檢測(cè)范圍（IC20～I(xiàn)C80）為2.34～300 ng/mL;所建立的對(duì)硫磷ic-ELISA與5種有機(jī)磷農(nóng)藥（丙溴磷、殺撲磷、倍硫磷、水胺硫磷和甲拌磷）均無(wú)交叉反應(yīng)。對(duì)比ic-ELISA和GC測(cè)定西紅柿樣品中對(duì)硫磷的添加回收試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)ic-ELISA的添加回收率為84.86%～100.27%，GC的添加回收率為97.60%～106.40%，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果一致性較好。【結(jié)論】建立的ic-ELISA可用于快速檢測(cè)蔬菜、水果等農(nóng)產(chǎn)品中的對(duì)硫磷殘留。

關(guān)鍵詞： 對(duì)硫磷;間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析方法（ic-ELISA）;單克隆抗體;氣相色譜法（GC）

中圖分類(lèi)號(hào)： S482.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）05-1193-08

Abstract：【Objective】To develop of monoclonal antibody against parathion（PA） and establish its indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay（ic-ELISA） to provide technical support for the rapid detection of parathion residue. 【Method】4-（diethoxyphosphorothioyloxy） benzoic acid was used as hapten to prepare artificial antigen by coupling with bovine serum albumin（BSA） and ovalbumin（OVA）. The spleen cells of the immunized 7-week-old Balb/c female mice whose antiserum titer was the highest and specificity was the optimal were fused with SP2/0 myeloma cells. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay（i-ELISA） and ic-ELISA were used to evaluate the positivity and specificity of the fusion cell lines， respectively. The monoclonal cell lines secreting parathion antibody stably were screened by limited dilution method. The standard curve of ic-ELISA for parathion was established based on the best working concentration combination of antigen and antibody selected by checkerboard test. And the specificity of the established ic-ELISA for parathion was evaluated based on cross-reactivity rates between parathion monoclonal antibody and each analogue. The ic-ELISA was used to test the recovery of parathion in tomato samples， and its accuracy was verified with gas chromatography（GC）. 【Result】Parathion artificial antigen PA-BSA and PA-OVA were successfully synthesized. After five times of immunization， the serum titer of the fusion mice was 8×103. The cell line 4F11A10 with the highest sensitivity and specificity of parathion was selected by limited dilution method. The ic-ELISA for parathion and its standard curve were established by using 2 μg/mL coated antigen PA-OVA and 0.25 μg/mL antibody secreted from cell line 4F11A10 as the best working concentration combination of antigen and antibody. The 50% inhibiting concentration（IC50） of this method was 50 ng/mL， and the detection range（IC20-IC80） was 2.34-300 ng/mL. There was no cross reactivity between ic-ELISA for parathion and five organophosphorus pesticides（profenofos， methidathion， fenthion， isocarbophos， phorate）. The results of parathion recovery tests in tomato samples determined by ic-ELISA and GC were compared. The recoveries of ic-ELISA and GC were 84.86%-100.27% and 97.60%-106.40%， respectively. The results of the two methods were consistent. 【Conclusion】The established ic-ELISA method can be used for the rapid detection of parathion residues in vegetables， fruits， and other agricultural products.

Key words： parathion; indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay（ic-ELISA）; monoclonal antibody; gas chromatography（GC）

Foundation item： Guangxi Key Research and Development Project（Guike AB17292070）; Guangxi Natural Science Foundation（2017GXNSFBA198241）;Guangxi Innovation Driven Development Project（Guike AA17204043）;Basic Scien-tific Research Project of Guangxi Subtropical Crops Research Institute（Guireyan 201702）

0 引言

【研究意義】對(duì)硫磷（Parathion，PA）是一種有機(jī)磷類(lèi)殺蟲(chóng)劑，其作用機(jī)制是通過(guò)抑制乙酰膽堿脂酶活性，干擾昆蟲(chóng)神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)進(jìn)而達(dá)到殺蟲(chóng)目的。該農(nóng)藥能通過(guò)多種途徑暴露進(jìn)入人體，中毒重癥者昏迷蘇醒后，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生興奮、語(yǔ)無(wú)倫次、幻覺(jué)等精神癥狀（Butler-Dawson et al.，2016;Soares et al.，2019）。我國(guó)于2002年已禁止使用對(duì)硫磷，但在水體、土壤、空氣及蔬菜中仍可檢測(cè)到該農(nóng)藥的殘留。因此，為保證人體健康和飲用水源及蔬菜產(chǎn)品的安全，建立一種特異性針對(duì)對(duì)硫磷農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法顯得尤為重要。【前人研究進(jìn)展】近年來(lái)，主要使用色譜法檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中的對(duì)硫磷殘留情況（林塬等，2018;戚文華等，2019）。這些實(shí)驗(yàn)室大型儀器檢測(cè)方法準(zhǔn)確、靈敏，但存在費(fèi)時(shí)、價(jià)格昂貴、操作繁瑣等問(wèn)題而難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。酶聯(lián)免疫分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一種基于抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)分析方法，具有快速、靈敏、價(jià)廉、省時(shí)、能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速篩選及檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)（王華等，2007）。Wettach等（2002）利用兔抗血清建立了對(duì)硫磷間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法（Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，ic-ELISA），其中對(duì)硫磷的半抑制濃度（IC50）為5.5 μg/L，但該方法與對(duì)氧磷、甲基對(duì)硫磷、O，O，O-三乙基硫代磷酸酯等多個(gè)對(duì)硫磷結(jié)構(gòu)類(lèi)似物均存在交叉反應(yīng)。我國(guó)也有一些學(xué)者針對(duì)對(duì)硫磷的免疫檢測(cè)方法進(jìn)行探究。鄧浩等（2013）利用免疫新西蘭大白兔所獲抗血清建立了對(duì)硫磷間接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫吸附分析方法，該方法的檢測(cè)線(xiàn)性范圍為0.24～15.83 μg/L，IC50為1.14 μg/L，檢出限為0.09 μg/L;李曉麗等（2017）建立的對(duì)硫磷ic-ELISA檢測(cè)線(xiàn)性范圍為0.012～24.14 μg/mL，IC50為0.542 μg/mL，檢出限為0.00343 μg/mL。此外，有研究人員利用有機(jī)磷農(nóng)藥廣譜特異性單克隆抗體檢測(cè)對(duì)硫磷。李盼等（2017）建立的ic-ELISA能同時(shí)檢測(cè)14種有機(jī)磷農(nóng)藥，但檢測(cè)對(duì)硫磷的IC50較高;鄒茹冰等（2017）通過(guò)運(yùn)用寬譜特異性單克隆抗體建立了同時(shí)檢測(cè)3種有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥（對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷和殺螟硫磷）的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法。【本研究切入點(diǎn)】現(xiàn)有的對(duì)硫磷免疫檢測(cè)方法大多存在與多種有機(jī)磷農(nóng)藥交叉反應(yīng)的現(xiàn)象，參照我國(guó)現(xiàn)行GB 2763—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》蔬菜樣品中對(duì)硫磷農(nóng)藥最大殘留限量的要求，本研究擬在單克隆細(xì)胞株篩選階段，提前采用ic-ELISA檢測(cè)細(xì)胞株分泌抗體與部分對(duì)硫磷結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的交叉反應(yīng)情況，以保證所篩得抗體的特異性，并以此建立高靈敏度、高特異性的對(duì)硫磷ic-ELISA。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】篩選針對(duì)對(duì)硫磷的高特異性單克隆抗體，建立高靈敏度、高特異性的對(duì)硫磷ic-ELISA，為實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速、專(zhuān)一篩選對(duì)硫磷農(nóng)藥殘留產(chǎn)品提供更簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)手段，也為后期流動(dòng)層析免疫分析方法的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

7周齡的Balb/c雌性小鼠購(gòu)自廣州動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心;小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供;試驗(yàn)所用蔬菜購(gòu)自廣西南寧市本地市場(chǎng)。6種有機(jī)磷類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[對(duì)硫磷（99.0%）、丙溴磷（99.0%）、殺撲磷（99.0%）、倍硫磷（99.0%）、水胺硫磷（99.0%）和甲拌磷（99.0%）]購(gòu)自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所;弗氏佐劑、基礎(chǔ)培養(yǎng)液（DMEM）、HAT粉樣和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

主要儀器設(shè)備：UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司]、Moshot MSX2型倒置顯微鏡（廣州市明美光電技術(shù)有限公司）、Infinite M200型酶聯(lián)檢測(cè)儀（瑞士TECAN公司）、CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、Agilent 6890N型氣相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）、GL-3250C型磁力攪拌器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）和移液器（德國(guó)Eppendorf公司）。

1. 2 對(duì)硫磷抗原合成及單克隆抗體制備

1. 2. 1 對(duì)硫磷半抗原、完全抗原合成及鑒定 參照Xu等（2011）的方法合成半抗原，其結(jié)構(gòu)式為：4-（二乙氧基硫代磷酸酯基）苯甲酸[4-（diethoxyphosphorothioyloxy） benzoic acid]，如圖1-A所示。采用活潑酯法（Xu et al.，2009）將半抗原偶聯(lián)到載體蛋白上，其中免疫抗原采用的載體蛋白為牛血清白蛋白（BSA），包被抗原則采用卵清白蛋白（OVA）作為載體蛋白。完全抗原的合成結(jié)構(gòu)如圖1-B所示，所有偶聯(lián)物均采用紫外吸收光譜進(jìn)行掃描鑒定。

1. 2. 2 免疫方案及小鼠血清效價(jià)測(cè)定 使用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）將對(duì)硫磷免疫抗原稀釋至1.0 g/L。免疫方案如表1所示，將完全弗氏佐劑與等體積的免疫抗原混合，充分乳化，對(duì)5只7周齡Bal b/c雌性小鼠進(jìn)行初次免疫，每只小鼠免疫劑量為200 μL，免疫部位為背部皮下或腹腔。第3次免疫后第7 d，對(duì)小鼠進(jìn)行眼周采血，離心后分離血清。用ic-ELISA檢測(cè)小鼠血清效價(jià)，效價(jià)定義為吸光值（A）為1.00時(shí)抗血清最大稀釋倍數(shù)，選取效價(jià)最高的小鼠為融合小鼠。融合前4 d對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

1. 2. 3 細(xì)胞融合與單克隆抗體篩選 在50% PEG- 2000作用下融合小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0（細(xì)胞數(shù)目比值約10∶1）9～11 d，以間接酶聯(lián)免疫方法（i-ELISA）評(píng)價(jià)融合細(xì)胞株的陽(yáng)性，再采用ic-ELISA篩選特異性強(qiáng)的細(xì)胞株，抑制孔的對(duì)硫磷濃度設(shè)為300 ng/mL，最終通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞單克隆化處理，得到穩(wěn)定分泌特異性識(shí)別對(duì)硫磷的雜交瘤細(xì)胞株。

1. 2. 4 單克隆抗體制備及純化 制備腹水前1周，選取5只7周齡Balb/c雌性小鼠，注射0.5 mL無(wú)菌石蠟油破壞其免疫系統(tǒng)，隨后將1.2.3篩選所得單克隆細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)繁，制備腹水。1周后留心觀察小鼠，當(dāng)發(fā)現(xiàn)小鼠腹腔部位明顯膨大后可收集腹水。將腹水靜置約4 h后，3000 r/min離心10 min，除去脂肪層和細(xì)胞層，僅收集中間澄清液，再用飽和硫酸銨法（朱立平和陳學(xué)清，2000）純化澄清液，蒸餾水透析后凍干，即得純化單克隆抗體。

1. 3 對(duì)硫磷ic-ELISA建立

1. 3. 1 抗原抗體最佳工作濃度篩選 采用ic-ELISA，通過(guò)棋盤(pán)格試驗(yàn)對(duì)包被抗原和抗體的最佳工作濃度組合進(jìn)行篩選，即選定在492 nm下測(cè)定吸光值時(shí)，可實(shí)現(xiàn)A492 nm在1.00以上，抑制率高于90%的包被抗原和抗體組合即為最佳工作濃度組合。

1. 3. 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立 采用ic-ELISA對(duì)系列濃度的對(duì)硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，以抗原抗體的結(jié)合率（B/B0）為縱坐標(biāo)、對(duì)硫磷系列濃度為橫坐標(biāo)，建立對(duì)硫磷ic-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1. 3. 3 特異性分析 在相同工作條件下，采用ic-ELISA建立對(duì)硫磷及與其結(jié)構(gòu)類(lèi)似的有機(jī)磷農(nóng)藥（丙溴磷、殺撲磷、倍硫磷、水胺硫磷和甲拌磷）的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)計(jì)算IC50分別求出對(duì)硫磷單克隆抗體與各有機(jī)磷農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率，計(jì)算公式為：交叉反應(yīng)率（%）=IC50（對(duì)硫磷）/IC50（有機(jī)磷農(nóng)藥）×100。根據(jù)算得的交叉反應(yīng)率對(duì)所建立的對(duì)硫磷ic-ELISA特異性進(jìn)行評(píng)估。

1. 3. 4 基質(zhì)效應(yīng)影響和方法準(zhǔn)確性分析 為考察不同濃度基質(zhì)對(duì)ic-ELISA準(zhǔn)確性的影響，取空白西紅柿樣品，參照NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲(chóng)菊酯和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥多殘留的測(cè)定》進(jìn)行前處理。為獲得一系列含不同濃度基質(zhì)的緩沖液，提取樣品經(jīng)氮?dú)獯蹈珊螅肞BS緩沖液將基質(zhì)稀釋至目標(biāo)倍數(shù)（5×、8×和10×），并利用各稀釋倍數(shù)的基質(zhì)緩沖液將對(duì)硫磷標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋為25、50和75 ng/mL 3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度后進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，測(cè)定不同濃度基質(zhì)緩沖液中添加對(duì)硫磷的含量，計(jì)算添加回收率。選擇對(duì)方法性能影響最小的稀釋倍數(shù)進(jìn)行方法建立，再按上述方法提取兩份等量西紅柿樣品進(jìn)行第2次對(duì)硫磷添加回收試驗(yàn)，一份以ic-ELISA進(jìn)行檢測(cè)，一份以氣相色譜法（GC）進(jìn)行檢測(cè)，將兩種方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證ic-ELISA的準(zhǔn)確性。

添加回收率（%）=（樣品實(shí)測(cè)添加濃度-對(duì)照空

白添加濃度）/樣品實(shí)測(cè)添加

濃度×100

1. 3. 5 GC測(cè)定對(duì)硫磷含量 GC條件：毛細(xì)管色譜柱型號(hào)DB-1701（30 m×530 ?m×1.0 ?m），固定液為DB-35;檢測(cè)器溫度250 ℃，進(jìn)樣口溫度220 ℃;載氣為氮?dú)猓銐翰环至鳎髁?0.0 mL/min，氫氣75.0 mL/min，空氣100 mL/min，柱溫采用程序升溫：初始溫度150 ℃，以10 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，再以15 ℃/min升至250 ℃，保持2 min;進(jìn)樣量1.00 ?L。

2 結(jié)果與分析

2. 1 人工抗原鑒定結(jié)果

將載體蛋白BSA、OVA、合成半抗原及偶聯(lián)產(chǎn)物分別用PBS緩沖液調(diào)整濃度至1.0 mg/mL后，進(jìn)行紫外吸收光譜掃描。如圖2所示，對(duì)硫磷合成半抗原Hapten-PA、BSA和OVA的最大吸收峰分別在283、285和286 nm處;免疫抗原PA-BSA、包被抗原PA-OVA的吸收曲線(xiàn)與相應(yīng)的半抗原及載體蛋白相比，均發(fā)生明顯改變;PA-BSA和PA-OVA與各自載體蛋白相比，在283～286 nm最大吸收峰的吸光值明顯不同，表明人工抗原合成成功。

2. 2 融合小鼠的篩選結(jié)果

在融合前4 d進(jìn)行小鼠血清效價(jià)與抑制率檢測(cè)，篩選效價(jià)高、抑制好的小鼠加強(qiáng)免疫。由表2可知，融合小鼠的血清效價(jià)為8×103，當(dāng)包被抗原PA-OVA（1.0 mg/mL）按1∶2000稀釋、血清按1∶4000稀釋時(shí)，該融合小鼠血清對(duì)100 ng/mL對(duì)硫磷的抑制效率可達(dá)50%，因此選擇該稀釋濃度下的抗原抗體組合進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞篩選。

2. 3 單克隆抗體的制備結(jié)果

加強(qiáng)免疫后，將小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合處理9～11 d，用i-ELISA篩選陽(yáng)性細(xì)胞孔，每孔中包被抗原的濃度為0.5 μg/mL。經(jīng)初檢發(fā)現(xiàn)，有13個(gè)融合孔表現(xiàn)出較強(qiáng)的陽(yáng)性（表3）。對(duì)選取的13個(gè)強(qiáng)陽(yáng)性孔進(jìn)行抗對(duì)硫磷特異性檢測(cè)，挑選抑制率高的孔，用有限稀釋法對(duì)其進(jìn)行多次克隆，最終篩選出1株效價(jià)較高、特異性最優(yōu)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，將其命名為4F11A10（圖3）。擴(kuò)大培養(yǎng)該細(xì)胞株，制備腹水后用飽和硫酸銨法純化抗體。

2. 4 最佳抗原抗體工作濃度的篩選結(jié)果

由表4可知，當(dāng)包被抗原PA-OVA稀釋500倍（2 μg/mL）、抗體稀釋4000倍（0.25 μg/mL）時(shí)，對(duì)照孔的吸光值A(chǔ)492 nm在1.00以上，且抑制孔的抑制率高于90%，為建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的最佳抗原抗體工作濃度組合。

2. 5 ic-ELISA檢測(cè)對(duì)硫磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

以對(duì)硫磷系列濃度為橫坐標(biāo)、抗原抗體結(jié)合率為縱坐標(biāo)，經(jīng)Logit函數(shù)擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖4），4F11A10分泌的抗體IC50為50 ng/mL，檢測(cè)范圍IC20～I(xiàn)C80（抑制率為20%～80%的對(duì)硫磷濃度）為2.34～300 ng/mL，相關(guān)系數(shù)為0.9999。說(shuō)明本研究的對(duì)硫磷半抗原結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合理，通過(guò)人工抗原的成功合成及免疫，能制備出與對(duì)硫磷分子特異性結(jié)合的抗體。

2. 6 特異性分析結(jié)果

選取對(duì)硫磷的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物丙溴磷、殺撲磷、倍硫磷、水胺硫磷和甲拌磷，考察所建立檢測(cè)方法的特異性。由表5可知，單克隆抗體4F11A10與其他結(jié)構(gòu)類(lèi)似物均無(wú)交叉反應(yīng)，表明以該單克隆抗體可建立特異性針對(duì)對(duì)硫磷的ic-ELISA。

2. 7 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

本研究目標(biāo)開(kāi)發(fā)的對(duì)硫磷酶聯(lián)免疫試劑盒，主要提供特異性針對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中對(duì)硫磷殘留的快速檢測(cè)方法。向?qū)嶋H蔬菜樣品中添加對(duì)硫磷，其添加回收率能反映該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，但不同濃度基質(zhì)對(duì)ic-ELISA的準(zhǔn)確性存在影響。可利用背景干擾排除試驗(yàn)確定ic-ELISA檢測(cè)樣品的最佳稀釋倍數(shù)。

從廣西南寧市本地市場(chǎng)購(gòu)回的西紅柿樣品經(jīng)GC檢驗(yàn)不含對(duì)硫磷。采用ic-ELISA測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算系列不同濃度基質(zhì)緩沖液背景下（目標(biāo)稀釋倍數(shù)為5×、8×和10×），每份西紅柿樣品的實(shí)測(cè)添加濃度值，再計(jì)算添加回收率。結(jié)果如表6所示，在5×、8×和10×稀釋倍數(shù)下的添加回收率為71.35%～107.69%，表明3個(gè)稀釋倍數(shù)下的基質(zhì)背景均滿(mǎn)足ic-ELISA對(duì)準(zhǔn)確度和精密度的要求。當(dāng)基質(zhì)緩沖液的目標(biāo)稀釋倍數(shù)為8×?xí)r，對(duì)硫磷的添加回收率范圍在71.35%～96.10%，更接近100.00%，故選擇該稀釋倍數(shù)進(jìn)行第二輪對(duì)硫磷添加回收試驗(yàn)，同時(shí)采用GC進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如表7所示，ic-ELISA檢測(cè)對(duì)硫磷的回收率為84.86%～100.27%，加標(biāo)樣品經(jīng)GC驗(yàn)證的回收率為97.60%～106.40%，兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致性好，表明所建立的對(duì)硫磷ic-ELISA對(duì)農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)督具有良好的實(shí)用性。

3 討論

本研究所用的半抗原4-（二乙氧基硫代磷酸酯基）苯甲酸是以O(shè)，O-二乙基硫代磷酰氯與4-羥基苯甲酸反應(yīng)制取，隨后選擇保留乙氧基磷酸酯和芳香環(huán)，利用苯環(huán)對(duì)位上的羧基偶聯(lián)載體蛋白制備免疫抗原和包被抗原。所制備的單克隆抗體4F11A10與丙溴磷、殺撲磷、倍硫磷、水胺硫磷和甲拌磷均無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好。李盼等（2017）同樣利用4-（二乙氧基硫代磷酸酯基）苯甲酸作為半抗原，偶聯(lián)載體蛋白血藍(lán)蛋白合成完全抗原免疫小鼠，所制備的單克隆抗體可廣譜性識(shí)別14種O，O-二乙基類(lèi)有機(jī)磷農(nóng)藥，但對(duì)每種農(nóng)藥的特異性不同;其對(duì)對(duì)硫磷的IC50為0.165 μg/mL（交叉反應(yīng)率為1134%），對(duì)丙溴磷的IC50為2.583 μg/mL（交叉反應(yīng)率為72%），對(duì)甲拌磷的IC50為5.578 μg/mL左右（交叉反應(yīng)率為33%）。雖然都是通過(guò)同樣的半抗原結(jié)構(gòu)偶聯(lián)載體大蛋白分子制備完全抗原，但本研究在單克隆細(xì)胞株篩選的初期，除了檢測(cè)融合細(xì)胞孔的陽(yáng)性，同時(shí)采用ic-ELISA檢測(cè)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞孔的特異性，即設(shè)置多個(gè)抑制孔，分別添加不同對(duì)硫磷類(lèi)似物以檢測(cè)抗體的識(shí)別效應(yīng)。為確保所得單克隆細(xì)胞株具備強(qiáng)特異性，將與對(duì)硫磷類(lèi)似物存在交叉反應(yīng)的細(xì)胞融合孔舍棄，因此本研究與李盼等（2017）分別篩選獲得具備不同特異性的對(duì)硫磷單克隆抗體。除了可在單克隆細(xì)胞株篩選階段提前檢測(cè)與目標(biāo)檢測(cè)對(duì)象結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的交叉情況，以提高抗體的特異性，還可通過(guò)在通用半抗原的基礎(chǔ)上引入取代基來(lái)提高有機(jī)磷農(nóng)藥單克隆抗體的特異性。Piao等（2009）在半抗原4-（二乙氧基硫代磷酸酯基）苯甲酸的基礎(chǔ)上，在苯環(huán)的間位加入1個(gè)取代基，制備的抗體對(duì)毒死蜱、殺螟松和二嗪噥等間位有取代基的農(nóng)藥具有較強(qiáng)的特異性。

當(dāng)前市場(chǎng)上針對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中對(duì)硫磷的殘留檢測(cè)大多仍采用儀器檢測(cè)手段，雖然已有相關(guān)研究報(bào)道了對(duì)硫磷ELISA的摸索及建立（李盼等，2017;李曉麗等，2017），但均未見(jiàn)相關(guān)方法的后續(xù)推廣與應(yīng)用。本研究篩選獲得對(duì)硫磷特異性單克隆抗體，建立對(duì)硫磷ic-ELISA，并采用ic-ELISA和GC同時(shí)進(jìn)行西紅柿樣品中對(duì)硫磷的添加回收試驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)ic-ELISA方法靈敏度及準(zhǔn)確性的驗(yàn)證。該方法的建立將填補(bǔ)廣西農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)上對(duì)硫磷農(nóng)藥殘留快速免疫檢測(cè)技術(shù)的空白。進(jìn)一步利用該抗體開(kāi)發(fā)基于膠體金顆粒的對(duì)硫磷免疫層析試紙條（Liu et al.，2018），還可實(shí)現(xiàn)批量農(nóng)產(chǎn)品對(duì)硫磷殘留的現(xiàn)場(chǎng)快速初篩工作。

4 結(jié)論

利用半抗原4-（二乙氧基硫代磷酸酯基）苯甲酸偶聯(lián)載體蛋白合成完全抗原，免疫小鼠獲得抗對(duì)硫磷特異性單克隆抗體并建立對(duì)硫磷ic-ELISA，該方法可用于快速檢測(cè)蔬菜、水果等農(nóng)產(chǎn)品中的對(duì)硫磷殘留。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）