薄層色譜法的操作要點及影響因素

李 楊 姜慧瑩 陳嘉興 楊 爽 黃 帥（吉林職業技術學院延邊133400）

薄層色譜法系將供試品溶液點于薄層板上，在展開容器內用展開劑展開，使供試品所含成分分離，所得色譜圖與適宜的標準物質按同法所得的色譜圖對比[1，2]。薄層色譜法的操作分別是供試品溶液的制備、對照品或對照藥材溶液的制備、選擇吸附劑、點樣、展開、顯色與檢視。

1 實驗方法

1.1 供試品溶液的制備：根據選取的目標成分選用適宜的提取方法和提取溶劑，常用的提取方法包括浸泡、振搖、超聲等法、加熱回流等。提取的目標成分沸點較低，在提取時應注意不可加熱提取，應超聲或振搖浸泡提取，制備時不應受熱，在鑒別牡丹皮時，由于丹皮酚沸點為31℃，高溫蒸干后，丹皮酚易揮發，高溫揮干和室溫揮干的薄層色譜圖。如圖1所示。

1.2 選擇吸附劑：預制薄層板按固定相種類分為硅膠薄層板、鍵合硅膠板、微晶纖維素薄層板、聚酰胺薄層板、氧化鋁薄層板等。固定相中可加入黏合劑、熒光劑。硅膠薄層板常用的有硅膠G、硅膠GF254、硅膠H 、硅膠HF254、G、H 表示含或不含石膏黏合劑。F254為在紫外光254 nm波長下顯綠色背景的熒光劑。按固定相粒徑大小分為普通薄層板（10～4 μm）和髙效薄層板（5～10 μm）。自制的薄層板。固定相顆粒大小一般要求粒徑為10～40 pm。玻板應光滑、平整，洗凈后不附水珠。黏合劑通常為羧甲基纖維素鈉，配制時應均勻散落在水的表面，自然沉降，固定相與黏合劑通常為1∶3，混合后，沿一個方向研磨排除氣泡。稠度以用研棒黏取呈連珠狀而不呈線狀下滴為好[2]。薄層板鋪制完成后，置110℃下干燥30 min[3，4]。

在黏合劑加入適量的氫氧化鈉，鋪制的薄層板，在分離一些酸性成分時要優于硅膠G薄層板的分離效果，例如丹參的薄層色譜鑒別，分別選用硅膠G薄層板和堿板，同一條件下，堿板的分離效果較好，如圖2所示。

1.3 點樣：一般采用微升毛細管點樣，也可用自動點樣器。在薄層板點樣的斑點一般呈圓點狀或窄細的條帶狀，根據特征斑點在薄層色譜顯現的效果，選擇點樣方式。例如，黃芪的薄層色譜，在點樣的斑點呈圓點狀時，薄層色譜背景較深，可以選擇條帶狀點樣，使薄層色譜的背景拉伸變淺，特征斑點清晰，薄層色譜如圖3。

1.4 展開：展開前如需要溶劑蒸氣預平衡，可在展開缸中加入適量的展開劑，密閉，一般保持15～30 min。溶劑蒸氣預平衡后，應迅速放入載有供試品的薄層板，立即密閉，展開。如需使展開缸達到溶劑蒸氣飽和的狀態，則須在展開缸的內壁貼與展開缸高、寬同樣大小的濾紙，一端浸入展開劑，密閉一定時間，使溶劑蒸氣達到飽和再如法展開。如薄層色譜在分離生物堿時，需要在置氨蒸氣飽和的展開環境中展開，例如黃連的薄層色譜鑒別，未用濃氨溶液飽和的展開環境或氨蒸汽的濃度低都會導致薄層色譜的Rf值降低或主斑點不清晰，見圖4。

1.5 顯色與檢視：有顏色的物質可在可見光下直接檢視，無色物質可用噴霧法或浸潰法以適宜的顯色劑顯色，或加熱顯色，在可見光下檢視。有熒光的物質或顯色后可激發產生熒光的物質可在紫外光燈（365 nm或254 nm）下觀察熒光斑點。對于在紫外光下有吸收的成分，可用帶有熒光劑的薄層板（如硅膠GF254板），在紫外光燈（254 nm）下觀察熒光板面上的熒光物質淬滅形成的斑點。厚樸的薄層色譜鑒別，薄層色譜在經過碘蒸氣氧化后，在紫外254 nm下檢視，其特征斑點相比于未經碘蒸氣氧化更加清晰，如圖5。

2 結果與討論

薄層色譜法系將供試品溶液點于薄層上，在展開容器內用展開劑展開，供試品所含成分分離，所得色譜圖與適宜的標準物質按同法所得的色譜圖對比[1]，廣泛用于鑒別、檢査。其操作步驟中，影響因素較多，本研究于各操作步驟中選取實際應用的影響因素，討論薄層色譜在應用時的技術難點[5]。供試品溶液制備時需注意目標成分的熔沸點，以此作為依據進行供試品的制備。吸附劑的選擇要根據所分離的某一類目標成分來選擇，中藥復方制劑成分復雜，為薄層色譜檢測帶來許多困難，依據目標成分性質選擇適宜的吸附劑對于薄層色譜的分離存在較大影響。薄層色譜多用圓點點樣，條形點樣應用較少，對于皂苷分離效果不好的成分可以采用條形點樣的方式，使目標成分的特征斑點在分離條帶中剝離得更加清晰。薄層色譜展開操作中，氨水預飽和可以用于皂苷、生物堿的分離，根據成分間的相似相溶原理，薄層色譜目標成分斑點更加清晰，分離度較高。薄層色譜法檢視主要分為三種方式，日光檢視、紫外365 nm檢視、紫外254 nm檢視，可以根據特征成分的特性選擇適宜的氧化還原顯色劑，使檢視斑點更加清晰。