四水合七鉬酸銨細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法研究

崔 黎 韓 峰（內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院呼和浩特010020）

四水合七鉬酸銨為白色結(jié)晶性粉末，為混合微量元素注射液（10）的原料藥之一。根據(jù)《中國藥典》2015年版“化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法指導(dǎo)原則”的要求，作為注射劑原料，應(yīng)對其安全性指標(biāo)作為內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行考察。參照《中國藥典》2015年版四部通則方法，對四水合七鉬酸銨細(xì)菌內(nèi)毒素限量檢查的可行性進(jìn)行了方法驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

1.1 限值的確定：按照《中國藥典》2015年版四部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供的公式L=K/M進(jìn)行限值的確定。注射劑K=5 EU/kg·h。四水合七鉬酸銨為混合微量元素注射液（10）的原料之一，混合微量元素注射液（10）的臨床最大使用劑量為2瓶/人，每瓶中溶質(zhì)約為100 mg（實(shí)際為95.2 mg），內(nèi)毒素的限值：L=K/M=5 EU/KG/200 mg×60 kg=1.5 EU/mg。本著從嚴(yán)原則，擬定為：每1 mg四水合七鉬酸銨含細(xì)菌內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.2 EU。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 儀器：細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀：型號BET-48G，天津天大天發(fā)科技有限公司；旋渦混合器：型號IKA MS3 DS25，廣州儀科實(shí)驗(yàn)科技有限公司。

1.2.2 供試品：四水合七鉬酸銨批號：20160301、20160302、20160303。

1.2.3 試劑

1.2.3.1 鱟試劑：生產(chǎn)單位：湛江安度斯生物有限公司

規(guī)格：0.1 mL，批號：1603142，靈敏度：0.03 EU/mL

規(guī)格：0.1 mL，批號：1512181，靈敏度：0.125 EU/mL

生產(chǎn)單位：湛江海洋生物有限公司

規(guī)格：0.1 mL，批號：1601043，靈敏度：0.03 EU/mL

規(guī)格：0.1 mL，批號：1601110，靈敏度：0.125 EU/mL

1.2.3.2 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品：生產(chǎn)單位：中國食品藥品檢定研究院，規(guī)格：80 EU/支，批號：150601—201478。

1.2.3.3 內(nèi)毒素檢查用水：生產(chǎn)單位：湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格：5 mL/支，批號：1602160。

1.3 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)：按照《中國藥典》2015年版四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定，進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核，結(jié)果見表1、表 2。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核

結(jié)果：4批鱟試劑經(jīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品檢查，λc為λ的0.5～2.0倍，結(jié)果均符合規(guī)定。

1.4 干擾實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)

1.4.1 最大有效稀釋濃度（MVC）的計(jì)算：由公式MVC=λ/L

其中L為四水合七鉬酸銨的細(xì)菌內(nèi)毒素限值0.2 EU/mg，市售鱟試劑靈敏度λ范圍在0.5 EU/mL～0.03 EU/mL。

則四水合七鉬酸銨對應(yīng)有效稀釋濃度為：

MVC0.5=0.5 EU/ml÷0.2 EU/mg=2.50 mg/mL

MVC0.25=0.25 EU/ml÷0.2 EU/mg=1.25 mg/mL

MVC0.125=0.125 EU/ml÷0.2 EU/mg=0.62 mg/mL

MVC0.06=0.06 EU/ml÷0.2 EU/mg=0.30 mg/mL

MVC0.03=0.03 EU/ml÷0.2 EU/mg=0.15 mg/mL

1.4.2 實(shí)驗(yàn)操作：稱取四水合七鉬酸銨46.08 mg，加入內(nèi)毒素檢查用水2.3 mL充分溶解后，用內(nèi)毒素檢查用水分別稀釋為2.50 mg/mL、1.25 mg/mL、0.62 mg/mL、0.30 mg/mL、0.15 mg/mL，即為NPC。

同時(shí)在上述系列溶液中加入細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使試驗(yàn)液中均含有2 λ及0.25 λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素，記此系列溶液分別為PPC1和PPC2，每一濃度重復(fù)兩管。

取兩個(gè)不同廠家的鱟試劑，靈敏度為0.25 EU/mL，分別與上述PPC和NPC溶液進(jìn)行反應(yīng)，并設(shè)陽性和陰性對照。結(jié)果見表 2、表 3。

表2 四水合七鉬酸銨干擾預(yù)試驗(yàn)（湛江安度斯生物有限公司，批號：1512181 λ=0.125EU/mL）

表3 四水合七鉬酸銨干擾預(yù)試驗(yàn)（湛江海洋生物有限公司，批號：1601110 λ=0.125EU/mL）

由以上干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以初步了解：兩個(gè)廠家的鱟試劑對四水合七鉬酸銨的細(xì)菌內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)結(jié)果在0.15 mg/mL濃度及以下濃度時(shí)無干擾。

1.5 正式干擾實(shí)驗(yàn)：據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將3批供試品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋至終濃度為0.15 mg/mL的溶液，作為供試品陰性對照溶液，取內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為0.25，0.125，0.0625，0.03125 EU/mL的含供試品（濃度為0.15 mg/mL）溶液，同時(shí)做陰性對照和陽性對照。照《中國藥典》2015年版四部通則1143中的干擾試驗(yàn)，結(jié)果見表4、表5。

表4 四水合七鉬酸銨鈷干擾試驗(yàn)（湛江安度斯生物有限公司，批號：1603142 λ=0.03EU/mL）

表5 四水合七鉬酸銨干擾試驗(yàn)（湛江安度斯生物有限公司，批號：1601043 λ=0.03EU/mL）

表4、表 5 結(jié)果表明：ES在 0.5 λ～2 λ 之間，且 ET在 0.5 ES～2 ES范圍內(nèi)。說明0.15 mg/mL四水合七鉬酸銨在此試驗(yàn)條件下，對鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)無干擾。因此可以確認(rèn)四水合七鉬酸銨對鱟試劑無干擾的最大濃度為0.15 mg/mL，使用標(biāo)示靈敏度為0.03 EU/mL鱟試劑可對四水合七鉬酸銨進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

1.6 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查：按《中國藥典》2015年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，取標(biāo)示靈敏度為0.03 EU/mL的鱟試劑進(jìn)行檢查，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET）將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成4 λ，2 λ（陽性對照溶液）濃度的溶液，再將3批樣品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET）制成供試品溶液，同時(shí)作供試品陽性對照、陽性和陰性對照。分別用不同企業(yè)鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表6、表7。

表6 四水合七鉬酸銨細(xì)菌內(nèi)毒素檢查樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果（安度斯，批號：1603142）

表7 四水合七鉬酸銨細(xì)菌內(nèi)毒素檢查樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果（海洋，批號：1601043）

表6、表7結(jié)果表明，使用上述兩個(gè)廠家靈敏度為0.03 EU/mL的TAL對樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合規(guī)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：四水合七鉬酸銨在0.15 mg/mL及其以下濃度對鱟試劑凝集反應(yīng)無增強(qiáng)或抑制作用。

2.2 正式干擾實(shí)驗(yàn)表明：0.15 mg/mL及其以下濃度對鱟試劑凝集反應(yīng)無增強(qiáng)或抑制作用。分別考察不同企業(yè)生產(chǎn)的鱟試劑反應(yīng)結(jié)果一致，ES/ET均在0.5～2.0之間，確定無干擾，說明本品可用標(biāo)示靈敏度0.03 EU/mL鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.3 按照擬定的限值對三批四水合七鉬酸銨進(jìn)行了內(nèi)毒素限量檢查，結(jié)果均符合規(guī)定。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：根據(jù)以上試驗(yàn)，可以制定四水合七鉬酸銨檢查方法，取本品照（《中國藥典》2015年版四部通則1143）檢查，四水合七鉬酸銨中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.2 EU/mg。