環狀糊精葡萄糖基轉移酶工業生產中發酵染菌(Arthrobacter sp.AMP-5)的分離及16srDNA分析

段夢露，李 皎，鄧 媛，毛 勇，楊國武

(陜西省微生物研究所,陜西 西安 710043)

0 前言

β-環糊精( β-cyclodextrin，β-CD) 是由 7 個 D-吡喃葡萄糖基以 α-1，4 葡萄糖苷鍵連接成的環狀低聚糖。它具有中心疏水、外表面親水的圓臺形桶狀空間結構，因此能夠包埋疏水性分子或者基團從而形成包合物[1]。 經過環糊精包埋以后的分子或基團的理化性質，比如水溶性、穩定性、揮發性等都會發生改變，達到保護、穩定、增溶客體分子的功能，所以β-CD廣泛應用于食品、醫藥、石油、化工、環保等諸多領域[2～4]。

β-CD由β-CGTase作用于淀粉后使葡萄糖基發生轉移反應而獲得[5]，是具有高附加值的淀粉深加工產物，目前國內主要以玉米淀粉為生產原料。β-CGTase的工業化發酵生產大部分采用嗜堿性芽孢桿菌純培養完成[6～8]。在生產初期，由于培養條件的強堿性(pH>9)，發酵染菌的幾率極低。但是長時間連續生產導致環境中的嗜堿性菌群增加，生產廠家發酵染菌的現象越來越多，雜菌污染可能導致產品酶活降低，產量下降，從而直接影響生產效益，嚴重的已經發生連續倒罐，生產停滯，嚴重增加了企業的生產成本和負擔[9,10]。

我們團隊多年來致力于研究環糊精的工業化生產工藝，研究水平已處于國際領先水平。我們在對生產廠家進行技術服務過程中，在發酵異常的發酵液中分離到了一株在堿性條件下可以和正常生產菌共生的節桿菌，通過16sDNA分析發現該雜菌為節桿菌Arthrobacter sp.AMP-5。對生產過程進行實時監測，發現該菌優先于生產菌進行發酵，形成優勢菌群并降低發酵液pH值，進而抑制生產菌的增殖。由于β-CGTase生產屬于正壓發酵，發酵污染的來源可能是空氣過濾系統或菌種污染，因此通過預先鑒定生產菌種以及凈化空氣過濾系統，可以防止發酵染菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 菌株H02S：從生產廠家發酵異常的發酵液中分離得到嗜堿性蠟狀芽孢桿菌：陜西省微生物研究所保藏β-CGTase生產菌種其他試劑購自市售。

1.1.2 主要儀器設備 全自動立式電熱壓力蒸汽消毒器(YX-400ZN，上海三申醫療器械有限公司)；生物發酵智能控制系統及GUJS-10發酵罐(鎮江東方生物工程設備公司)；電熱恒溫培養箱(GH-600ASB，上海博訊實業有限公司)；恒溫培養搖床(ZHWY-2012，上海智誠分析儀器制造有限公司)；聚合酶鏈式反應儀(S1000，美國bio-rad公司)；水平式核酸電泳槽；紫外儀(WD-9430F，北京六一儀器制造廠)；小型震蕩儀(QL-901Vortox, 海門其林貝爾儀器制造有限公司)；精密臺式數顯pH計(PB-10，北京賽多利斯儀器系統有限公司)；722N型分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 發酵液酶活測定方法 采用碘液法測定β-CGTase 水解活性[11]。取 10 μL發酵液與0.2 mL Tris-HCl緩沖液(pH8.0)混合，再加入0.25%馬鈴薯淀粉溶液0.2 mL，振蕩，于40℃水浴中反應10 min 后，立即置于冰水浴中并加入0.5 molc 醋酸溶液 0.5 mL 終止反應，再加入 3 mL 0. 05 g ·L-1碘液顯色，同時以蒸餾水為空白，不加酶液為對照，在700 nm波長下比色。一個酶活力單位定義為每分鐘減低 10% 吸光度所需酶量。

一個酶活單位(U)=(a-b)/a×1000×酶液稀釋倍數

式中：a 為對照組的吸光度；b為樣品的吸光度。

1.2.2 發酵液光密度測定方法 吸取發酵液2 mL，以蒸餾水定容到50 mL，在單色波長600 nm處測得光密度值。

1.2.3 雜菌的篩選和分離 分離培養基：玉米漿(6%)，七水硫酸鎂(0.02%)，磷酸氫二鉀(0.1%)，馬鈴薯淀粉(1.5%)，瓊脂(2%)，溶解后調pH到7.0，加入無水碳酸鈉1%。

篩選培養基：以分離培養基為基礎，加入0.03%酚酞。

取發酵液按10的倍數逐級梯度稀釋，分別在分離培養基和篩選培養基上進行培養。

1.2.4 采用16srDNA技術進行菌種分析、鑒定 提取菌種的基因組DNA。根據細菌的16S rDNA的保守性，設計通用引物序列為，F：5-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3；R：5- TAC GGC TACCTTGTTACG ACTT-3，以基因組DNA為模板，PCR擴增程序為：95℃熱變性5 min；94 ℃/40 s，55℃/40 s，72℃/2 min，40個循環；72℃延伸 10 min，1.0 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。目的片段經膠回收和純化后，連接于 pGM-T 載體上，轉化至感受態細胞E．coli DH5α中， 37 ℃培養過夜。挑取單菌落培養并使T7和SP6測序引物進行菌落 PCR驗證 。PCR條件：95℃熱變性10 min；94℃/1 min，55℃/1 min，72℃/2 min，共 30個循環 ；72℃延伸 10 min。將驗證后的陽性克隆子菌液送至楊凌天潤奧科生物科技有限公司測序。使用BLAST搜索軟件在NCBI的GeneBank基因庫中對測序結果進行同源性分析和檢索，篩選出與目的菌種相似度匹配最高的種屬。

2 結果與討論

2.1 H02S菌種的分離篩選

對環糊精生產車間中發酵異常的發酵液進行分離篩選， 獲得一株可在強堿性(pH>9)的篩選培養基上正常生長的菌種H02S。如圖1所示，1為將一片蓋玻片置于培養基上，將培養基和pH試紙分離，試紙不變色，進一步證實了本實驗試紙的顯色是由堿性培養基引起的，與環境因素無關。菌落2為產β-CGTase的正常菌菌落，該菌落可在堿性培養基上正常生長(pH試紙顯色為堿性)，且菌落周圍產生褪色圈，這是由于正常菌產生的β-CGTase將培養基中的淀粉轉化為β-CD，β-CD包埋培養基中的酚酞從而在菌落周圍產生了褪色圈。菌落3為分離雜菌H02S，該雜菌雖然可在強堿性培養基上生長(pH試紙顯色為堿性)，但不能生產分泌β-CGTase，所以菌落周圍無褪色圈。

2.2 H02S菌種的16SrDNA分析

對H02S進行16SrDNA克隆和測序，使用BLAST在GeneBank基因庫中進行同源性搜索和多序列比對，如圖2所示，經比對H02S應歸屬于Arthrobacter sp.AMP-5，與正常生產菌種屬不同。

2.3 H02S菌種發酵生長曲線

將正常菌和H02S雜菌分別接入10 L全自動發酵罐，以相同培養條件進行發酵，并記錄兩種菌的發酵生長曲線。如圖3所示，在0～8 h之間，兩種菌的生長速度幾乎相同，隨后8～16 h之間雜菌H02S的生長速度高于正常菌，且雜菌在16 h菌體密度達到峰值，而生長至16 h之后，正常菌的菌體密度超過雜菌H02S。由此分析，在工業生產中，如果發酵罐染菌，雜菌會優先于生產菌進行發酵，形成優勢菌群從而抑制正常生產菌的生長，導致發酵失敗。

2.4 H02S菌種發酵pH值變化曲線

將正常菌和H02S雜菌分別接入10 L全自動發酵罐，以相同培養條件進行發酵，并記錄兩種菌發酵過程中的pH值變化。如圖4所示，兩種菌的發酵過程中pH值均呈現先下降后略有上升的趨勢。由此分析，在工業生產中可能H02S優先于生產菌進行發酵，使發酵液pH值降低，不利于正常生產菌的增殖，并且增加了污染環境中其他雜菌的可能性。

2.5 H02S菌種發酵過程中的酶活變化

將正常菌和H02S雜菌分別接入10 L全自動發酵罐，以相同培養條件進行發酵，并記錄兩種菌發酵過程中的酶活的變化。如圖5所示，正常生產菌的酶活在28 h達到峰值4 257.41 U·mL-1，而H02S則不產酶。

3 結論

本團隊在對β-CGTase生產廠家進行技術服務過程中，在發酵異常的發酵液中分離到了一株在堿性條件下可以和正常生產菌共生的雜菌H02S；對該雜菌進行16srDNA基因分析鑒定，發現該雜菌為節桿菌Arthrobacter sp.AMP-5；將該雜菌與正常生產菌分別進行發酵，在發酵初期雜菌H02S的生長速度明顯高于正常菌，同時pH值快速下降，且發酵全程H02S不產酶。根據多年生產經驗，由于β-CGTase生產屬于正壓發酵，發酵污染的來源可能是空氣過濾系統或菌種污染，導致了節桿菌優先于正常菌生長，迅速形成優勢菌群，消耗大量營養物質，同時降低了發酵液pH值，抑制正常菌的生長導致發酵失敗。因此，在工業發酵生產β-CGTase時，應預先采用16srDNA基因序列分析鑒定生產菌種，排除染雜菌的菌種；發酵崗位操作員也應嚴格執行空消和實消操作，定期排空空氣壓縮機儲罐內積水，對發酵過程中的酶活和pH值進行實時監測，以期及早發現發酵污染，并從源頭上消除發酵染菌的可能性。