余甘子總酚提取純化工藝的研究

趙春草 符曉暉 楊清云 夏增華 吳 飛* 張繼全*

（1.上海中醫(yī)藥大學創(chuàng)新中藥研究院， 中藥現(xiàn)代制劑技術教育部工程研究中心， 上海201203；2.上海同田生物技術股份有限公司， 上海201203； 3.蘇州凱祥生物科技有限公司， 江蘇 蘇州215600）

藏藥余甘子為大戟科植物余甘子Phyllanthus emblicaL.的干燥成熟果實，民間及臨床上常將其用于治療高尿酸血癥和痛風，安全性高，不良反應少［1］，療效確切［2-6］，主要含有多酚、生物堿、維生素、氨基酸、微量元素［7］，性涼，味甘、酸、澀，功效清熱涼血、消食健胃、生津止咳。近年來，對余甘子藥理活性成分的研究逐漸增多［8-10］，發(fā)現(xiàn)沒食子酸、葡糖倍苷是其主要成分，課題組前期對兩者組成的余甘子總酚進行了抗痛風活性研究，確定其具有較好的成藥性。

本實驗參考中藥創(chuàng)新藥物研究開發(fā)的相關要求，以余甘子多酚成分沒食子酸、葡糖倍苷含有量為指標，研究余甘子總酚提取純化工藝，以期保證原料中間體質量的均一、穩(wěn)定、可控，為該成分進一步開發(fā)成中藥有效部位制劑的創(chuàng)新藥物奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290型高效液相色譜儀，配置DAD 檢測器（美國安捷倫科技公司）；XP205型電子分析天平［0.01 mg，梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］；HWS26型恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；SC-150型不銹鋼層析柱（江蘇沙家浜化工設備有限公司）；LD-Y1000A型粉碎機（上海頂帥電器有限公司）；R-210型旋轉蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）。

1.2 試劑與藥物 余甘子藥材（批號150815） 購自安國市一方中藥材有限公司，經上海中醫(yī)藥大學中藥學院生藥教研室倪梁紅副教授鑒定為正品。沒食子酸對照品（批號110831-201204） 購自中國食品藥品檢定研究院；葡糖倍苷對照品（批號0761-20140922） 購自上海純優(yōu)生物科技有限公司。大孔吸附樹脂［型號AB-8，購自天津正天成澄清技術有限公司；型號D101，購自天津農藥股份有限公司樹脂分公司；型號XAD1600，美國羅門哈斯（陶氏） 公司生產，購自北京慧德易科技有限責任公司；型號Diaion HP-20，日本三菱公司生產，購自北京綠百草科技發(fā)展有限公司；型號HZ-801，購自上海華震科技有限公司］。乙腈、甲醇為色譜純，購自德國Merck 公司；其余試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法與結果

2.1 總酚含有量測定

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸對照品適量，50%甲醇定容至10 mL 棕色量瓶中，制得質量濃度1.187 mg／mL 的溶液，精密量取1 mL，50%甲醇稀釋至25 mL，即得質量濃度47.48 μg／mL的溶液，同法依次稀釋成5.94、23.74、47.48、118.70、237.40、474.80 μg／mL。

精密稱取葡糖倍苷對照品適量，50%甲醇定容至10 mL 棕色量瓶中，制得質量濃度1.138 mg／mL的溶液，精密量取1 mL，50%甲醇稀釋至10 mL，即得質量濃度113.8 μg／mL 的溶液，同法依次稀釋 成 11.38、45.52、113.80、227.60、455.20、910.40 μg／mL。

2.1.2 供試品溶液 精密稱取余甘子飲片粉末（過三號篩） 0.15 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，50%甲醇補足減失的質量，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流動相甲醇（A） -2%乙酸（B），梯度洗脫（0～3 min，95%A；3～10 min，95%～50% A；10～11 min，50%～10%A）；體積流量0.8 mL／min；柱溫35℃；檢測波長273 nm，進樣量5 μL。色譜圖見圖1。

2.1.4 方法學考察

2.1.4.1 線性關系考察 取“2.1.1” 項下2 種對照品溶液，在“2.1.3” 項色譜條件下各進樣5 μL測定。以峰面積為縱坐標（Y），溶液質量濃度為橫坐標（X） 進行回歸，得方程分別為沒食子酸Y＝19.003X-32.543（r＝1）、葡糖倍苷Y＝9.685X-36.149（r＝0.999 9），分別在5.94～474.80、11.38～910.4 μg／mL 范圍內呈良好的線性關系。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.4.2 精密度試驗 取1.187 mg／mL 沒食子酸對照品溶液、1.138 mg／mL 葡糖倍苷對照品溶液，在“2.1.3” 項色譜條件下進樣測定6 次，每次5 μL，測得沒食子酸、葡糖倍苷峰面積RSD 分別為0.65%、0.22%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 重復性試驗 取余甘子飲片粉末（過三號篩），按“2.1.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.3” 項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、葡糖倍苷含有量RSD 分別為1.94%、1.00%，表明該方法重復性良好。

2.1.4.4 穩(wěn)定性試驗 取余甘子飲片粉末（過三號篩），按“2.1.2” 項下方法平行制備2 份供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12 h 在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、葡糖倍苷峰面積RSD 分別為0.21%、0.10%，表明室溫下溶液在12 h 內穩(wěn)定性良好。

2.1.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取14 mg 余甘子飲片粉末9 份，精密加入一定量沒食子酸、葡糖倍苷對照品溶液，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，沒食子酸、葡糖倍苷平均加樣回收率分別為100.37%、99.80%，RSD 分別為1.24%、0.90%。

2.2 提取工藝考察

2.2.1 單因素試驗 取余甘子飲片50 g，以溶劑種類、提取次數、提取時間為影響因素進行單因素試驗，每個條件設3組平行對照。雖然水提取、70%乙醇提取時葡糖倍苷、沒食子酸轉移率均達到最大值，而且基本相同（圖2），但水提取時粗提取目標部位純度較低，故采用乙醇作為提取溶劑。

圖2 沒食子酸、葡糖倍苷轉移率Fig.2 Transfer rates of gallic acid and glucogallin

2.2.2 正交試驗 以溶劑用量（A）、提取時間（B）、提取次數（C） 為影響因素，每個因素3個水平；以2 種成分轉移率為評價指標，計算綜合評分（Y），公式為Y＝（沒食子酸轉移率＋葡糖倍苷轉移率） ×0.5／100，應用L9（34） 正交試驗進行優(yōu)化。因素水平見表1，結果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

由此可知，各因素影響程度依次為提取次數（C） ＞提取時間（B） ＞溶劑用量（A），其中C有顯著影響（P＜0.05），最優(yōu)提取工藝為A1B3C3，即溶劑用量8 倍，提取時間2 h，提取次數3 次。但在預實驗中發(fā)現(xiàn)，第3 次提取后引入的雜質量較大，給后續(xù)分離純化工作帶來困難，并導致純化效率降低，故將提取次數暫定為2 次。

2.2.3 提取工藝驗證試驗 按“2.2.2” 項下優(yōu)化工藝進行3 批驗證試驗，每批藥材取樣量為1 kg，結果見表4。另外還發(fā)現(xiàn)第2 次提取時間為1 h 時，提取效率與提取時間為2 h 時差異不大（相對誤差約為1%）。最終確定，最優(yōu)提取工藝為8 倍量70%乙醇回流提取2 次，第1 次2 h，第2次1 h。

2.3 純化工藝考察 余甘子提取后，粗提物中葡糖倍苷、沒食子酸總含有量為6.8%，為達到有效部位含有量不低于50%的要求，需作進一步分離純化。由于對大孔吸附樹脂的研究相對較為成熟，被廣泛應用于天然產物的分離和富集［11-14］，故本實驗應用該方法進行考察。按“2.2.3” 項下優(yōu)化工藝制備余甘子提取液，濃縮至浸膏，60℃下真空烘干，得到淺褐色干燥固體粉末，收率為48%，備用。

表2 試驗設計與結果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

表4 提取工藝驗證試驗結果（n＝3）Tab.4 Results of verification tests for extraction process（n＝3）

2.3.1 大孔吸附樹脂

2.3.1.1 種類 具有大孔結構的非極性大孔吸附樹脂可吸附極性較小的有機化合物［15］，本實驗選擇常用型號（AB-8、D101、XAD1600、HP-20、HZ-801），檢測其吸附量、解吸率，結果見表5。最終，選擇D101 大孔吸附樹脂作進一步分離純化工藝研究［16-17］。

表5 大孔吸附樹脂吸附量、解吸率測定結果Tab.5 Results of adsorption quantity and desorption rate determination of macroporous adsorption resins

2.3.1.2 層析柱徑高比 稱取預處理后的D101樹脂400 g，平均分為4 份，每份100 g，濕法裝柱。取4 份“2.3” 項下藥材粉末，加適量水制成0.2 g／mL 溶液，以1 BV／h 體積流量上樣，考察徑高比1∶3、1∶6、1∶10、1∶15 對沒食子酸、葡糖倍苷吸附率的影響，結果見圖3。由此可知，柱徑高比為1∶6 時2 種成分吸附率最高，故選擇其作進一步研究。

圖3 徑高比對沒食子酸、葡糖倍苷吸附率的影響Fig.3 Effects of diameter-height ratio on the adsorption rates of gallic acid and glucogallin

2.3.2 上樣藥液

2.3.2.1 上樣質量濃度 稱取預處理后的D101樹脂100 g，濕法裝柱，取“2.3” 項下藥材粉末，加適量水制成一定質量濃度溶液，以1 BV／h 體積流量上樣，考察上樣質量濃度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 g／mL 對沒食子酸、葡糖倍苷吸附率的影響，結果見圖4。由此可知，上樣質量濃度為0.2 g／mL時2 種成分吸附率最高，故選擇其作進一步研究。

圖4 上樣質量濃度對沒食子酸、葡糖倍苷吸附率的影響Fig.4 Effects of sample concentration on the adsorption rates of gallic acid and glucogallin

2.3.2.2 上樣體積流量 取“2.3” 項下藥材粉末，加適量水制成0.2 g／mL 溶液，考察體積流量0.5、1、1.5、2、2.5 BV／h 對沒食子酸、葡糖倍苷吸附率的影響，結果見圖5。由此可知，上樣體積流量越小吸附越充分，但周期也隨之延長，綜合考慮時間、吸附率，選擇1 BV／h作進一步研究。

圖5 上樣體積流量對沒食子酸、葡糖倍苷吸附率的影響Fig.5 Effects of sample volumetric flow rate on the adsorption rates of gallic acid and glucogallin

2.3.3 洗脫工藝 本實驗研究目的是確定合適的洗脫速率梯度，使水洗脫過程中水溶性雜質與目標部位達到良好的分離，并且目標部位活性組分含有量符合相關要求。

2.3.3.1 洗脫體積流量 稱取預處理后的D101樹脂100 g，平行5 份，濕法裝柱，徑高比為1∶6。取上樣液80 mL（沒食子酸、葡糖倍苷總含有量為10.64%），400 mL 純化水以不同體積流量進行洗脫，前1.5 BV 洗脫液棄去，收集第1.5～4 BV 洗脫液，濃縮干燥，測定2 種成分總含有量，結果見圖6。由此可知，洗脫體積流量越大，總含有量越低，但過大時水溶性雜質與目標組分不能得到很好的分離，從而影響終產品目標組分含有量，最終確定為1.5 BV／h。

2.3.3.2 加水量 稱取預處理后的D101 樹脂500 g，濕法裝入層析柱中，取“2.3” 項下藥材粉末，配制成0.2 g／mL 藥液100 mL，以1 BV／h 體積流量通過層析柱，用水洗脫，每半個柱體積收集1 份，直至無目標組分流出，再用50%、95%乙醇進行洗脫，接收液分別濃縮、干燥后得到固體粉末，測定沒食子酸、葡糖倍苷總含有量，結果見圖7。由此可知，當加水量達4 BV 時，目標組分已基本上完全被洗脫。合并1.5～4 BV 洗脫液，濃縮干燥后測得2 種成分總含有量為57.9%，符合預定要求，故選擇4 BV 水洗脫比較合適（前1.5 倍柱體積所含目標成分純度不高，棄去）。

圖6 洗脫體積流量對沒食子酸、葡糖倍苷總含有量的影響Fig.6 Effect of elution volumetric flow rate on the total content of gallic acid and glucogallin

圖7 加水量對沒食子酸、葡糖倍苷總含有量的影響Fig.7 Effect of water consumption on the total content of gallic acid and glucogallin

2.3.4 分離純化工藝確定 選用經預處理的D101 樹脂，柱徑高比為1∶6，上樣質量濃度為0.2 g／mL，上樣體積流量為1.5 BV／h，提取物用水溶解上柱，每500 g 樹脂先用750 mL（1.5 BV） 水洗脫除去部分非目標雜質，再用1 250 mL（1.5～4 BV） 水洗脫收集，濃縮干燥，得到余甘子總酚，其性狀為白色至淡黃色固體粉末，收率約為4.8%。

2.4 純化工藝驗證試驗 通過3 批驗證試驗可知，余甘子總酚有效部位中沒食子酸、葡糖倍苷總含有量均在50%以上，見表6。

表6 純化工藝驗證試驗結果（n＝3）Tab.6 Results of verification tests for purification process（n＝3）

3 討論與結論

根據《藥品注冊管理辦法》 的相關要求，中藥有效部位制劑定義為“未在國內上市銷售的從植物、動物、礦物等物質中提取的有效部位及其制劑，其有效部位含量應占提取物的50%以上”。為了提高有效部位原料的質量可控性、安全性、有效性，本研究以HPLC 法測定已知結構化合物含有量大于50%為目標，發(fā)現(xiàn)相比于紫外色譜法，有效部位含有量的要求進一步提高。

綜上所述，本實驗通過篩選大孔吸附樹脂材料、優(yōu)化余甘子總酚提取純化工藝，結合多批中試驗證，確定了抗痛風中藥有效部位制備工藝路線及參數，并參考了中藥有效部位新藥注冊申請的相關要求。上述研究過程和思路具有一定的代表性，可為同類新藥制備工藝的開發(fā)提供參考和借鑒。