一測多評法同時測定樸沉化郁丸中9 種成分

蔡 林 李 毅

（川北醫學院， 四川 南充637000）

樸沉化郁丸收載于2015 年版《中國藥典》 一部，由厚樸（姜制）、陳皮、香附（醋制）、延胡索（醋制）、枳殼（麩炒）、檀香等18 味藥材加工而成，具有舒肝化郁、開胃消食的功效，臨床上用于治療胸腹脹滿、消化不良、嘔吐惡心、停食停水、氣滯悶郁、胃脘刺痛等病癥［1］。

中成藥復方制劑由多味中藥材加工而成，每味均含有多種成分，臨床作用機制較為復雜，導致其質量控制研究面臨諸多困難。當前，大部分中成藥復方制劑采用單一指標控制模式，難以全面反映其品質；多指標控制模式近年來已逐步應用于相關質量控制中，但存在對照品不易獲得、使用量大、檢驗成本高等諸多不足。一測多評法利用中藥所含各成分之間存在的內在函數關系，通過測定1 種對照品穩定易得、價格低廉的成分，建立相對校正因子來計算其他成分含有量，以實現多種成分同時定量測定，可大大降低成本。因此，本實驗采用該方法同時測定樸沉化郁丸中柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃 酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿、四氫小檗堿的含有量，不僅可全面控制產品質量，而且解決了對照品難以獲得、價格昂貴的問題，從而實現該制劑多指標質量評價模式。

1 材料

Waters e2695型高效液相色譜儀購自美國Waters 公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀購自美國Agilent 公司；AB135-S型電子天平購自梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司；CY-5000型超聲波清洗器購自寧波新芝生物科技股份有限公司。

橙皮苷（批號110721-201818，純度96.2%）、α-香附酮（批號110748-201815，純度99.7%）、延胡索乙素（批號110726-201819，純度99.8%）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；川陳皮素（批號15032717，純度98.3%）、柚皮蕓香苷（批號14090302，純度99.5%）、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮（批號15042302，純度99.5%）、四氫小檗堿（批號PRF8050941，純度98.8%） 對照品均購于成都普瑞法科技開發有限公司；紫堇堿（批號17110821，純度99.6%）、去氫紫堇堿（批號16040732，純度98.8%） 對照品均購于上海同田生物技術股份有限公司。厚樸（姜制）、陳皮、香附（醋制）、延胡索（醋制）、枳殼（麩炒）、檀香、木香、片姜黃、柴胡、丁香、沉香、高良姜、青皮（醋制）、甘草、豆蔻、莪術（醋制）、砂仁、肉桂均購自四川省中藥飲片有限責任公司，經川北醫學院李毅主任中藥師鑒定為正品，按各藥材質量標準檢驗均符合規定。樸沉化郁丸（9 g／丸，批號4920096、4920101、4920115） 購自天津中新藥業集團股份有限公司達仁堂制藥廠。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters Xbridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -0.1% 冰醋酸（B）［2-4］，梯度洗脫（0～14.0 min，25.0%A；14.0～24.0 min，25.0%～40.0% A；24.0～39.0 min，40.0%～70.0%A；39.0～59.0 min，70.0%～81.0%A；59.0～65.0 min，81.0%～25.0%A）；體積流量0.9 mL／min；柱溫30℃；檢測波長300 nm（0～31.0 min，柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃 酮）［5-6］、242 nm（31.0～39.0 min，α-香附酮）［7］、280 nm（39.0～65.0 min，延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿、四氫小檗堿）［1，8-10］；進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿、四氫小檗堿對照品適量，70%乙醇分別制成每1 mL 含1.558、1.814、0.492、0.338、0.734、0.146、0.212、0.178、0.132 mg 上述成分的貯備液，分別精密吸取2.5 mL 置于50 mL 量瓶中，70%乙醇制成含柚皮蕓香苷77.9 μg／mL、橙皮苷90.7 μg／mL、川陳皮素24.6 μg／mL、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮16.9 μg／mL、α-香附酮36.7 μg／mL、延胡索乙素7.3 μg／mL、去氫紫堇堿10.6 μg／mL、紫堇堿8.9 μg／mL、四氫小檗堿6.6 μg／mL的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取丸劑適量，剪碎，混勻，取約5.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 70% 乙醇，稱定質量，加熱回流提取45 min，放冷，70% 乙醇補足減失的質量，搖勻，離心5 min，取上清液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按丸劑處方和工藝，分別制得缺陳皮、枳殼、青皮，缺香附，缺延胡索的陰性樣品，按“2.3” 項下方法制備，即得。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性考察 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，各成分與其他成分均能達到基線分離，分離度均大于1.5，理論塔板數以各成分計均不低于3 500，陰性無干擾。

2.5.2 線性關系考察 精密吸取“2.2” 項下貯備液各2.0 mL，置于同一20 mL 量瓶中，70% 乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液A，精密吸取適量，70% 乙醇依次稀釋2、4、8、16、20 倍，分別作為對照品溶液B～F，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5.3 精密度試驗 精密吸取“2.2” 項下對照品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿、四氫小檗堿峰面積RSD 分別為 0.60%、0.53%、1.74%、0.93%、0.87%、1.18%、1.02%、1.29%、1.35%，表 明儀器精密度良好。

2.5.4 重復性試驗 取同一批丸劑適量，按“2.3” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿、四氫小檗堿含有量RSD 分別為1.44%、1.27%、0.56%、1.60%、1.36%、0.89%、1.72%、1.86%、0.97%，表明該方法重復性良好。

2.5.5 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，室溫下，于0、2、4、8、12、16 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿、四氫小檗堿峰面積RSD 分別為0.63%、0.58%、1.69%、0.88%、0.52%、1.07%、0.98%、1.26%、1.41%，表明溶液在16 h 內穩定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 取同一批含有量已知的丸劑適量，剪碎后取9 份，每份約2.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，按照2015 年版《中國藥典》 四部藥品質量標準分析方法驗證指導原則要求，精密吸取對照品溶液（含柚皮蕓香苷0.882 mg／mL、橙皮苷1.056 mg／mL、川陳皮素0.322 mg／mL、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮0.178 mg／mL、α-香附酮0.544 mg／mL、延胡索乙素0.098 mg／mL、去氫紫堇堿0.136 mg／mL、紫堇堿0.114 mg／mL、四氫小檗堿0.078 mg／mL）0.5、1.0、1.5 mL 各3 份，按“2.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿、四氫小檗堿平均加樣回收率分別為98.59%、99.56%、97.94%、96.99%、99.91%、98.38%、99.12%、98.99%、97.49%，RSD 分別為1.28%、0.67%、1.45%、1.34%、0.98%、0.81%、1.17%、1.62%、0.84%。

2.5.7 相對校正因子測定 取“2.6” 項下對照品溶液A～F，在 “2.1” 項色譜條件下進樣測定。以延胡索乙素為內標，計算其他8 種成分的相對校正因子（f內／待），公式為f內／待＝f內／f待＝（A內×C待） ／（A待×C內），其中A內為延胡索乙素峰面積，C內為延胡索乙素質量濃度，A待為待測成分峰面積，C待為待測成分質量濃度，結果見表2。

表2 各成分相對校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.6 耐用性考察

2.6.1 儀器、色譜柱 取“2.1.2” 項下對照品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，考察Waters e2695、Agilent 1100 色譜儀，以及Waters Xbridge C18、Agilent Extend C18、Kromasil C18色譜柱對相對校正因子的影響，結果見表3，可知均無明顯影響（RSD＜2.0%）。

表3 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.6.2 體積流量 取“2.1.2” 項下對照品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，考察體積流量0.8、0.9、1.0 mL／min 對相對校正因子的影響，結果見表4，可知均無明顯影響（RSD＜2.0%）。

2.6.3 柱溫 取“2.1.2” 項下對照品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，考察不同柱溫25、30、35℃對相對校正因子的影響，結果見表5，可知均無明顯影響（RSD＜2.0%）。

2.7 色譜峰定位 以延胡索乙素（內標） 為基準峰，測定在“2.2.1” 項儀器、色譜柱下各成分相對保留時間，結果見表6，可知均無明顯影響（RSD＜2.0%）。

表4 不同體積流量對相對校正因子的影響Tab.4 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

表5 不同柱溫對相對校正因子的影響Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

表6 各成分相對保留時間Tab.6 Relative retention time of various constituents

2.8 樣品含有量測定 取3 批丸劑，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，分別采用外標法、一測多評法計算含有量，結果見表7，可知2 種方法所得結果無明顯差異（RSD＜2.0%）。

表7 各成分含有量測定結果（mg／g， n＝3）Tab.7 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝3）

3 討論

樸沉化郁丸中香附具有疏肝解郁、理氣止痛的功效，厚樸燥濕行氣、寬中除滿，合為君藥；陳皮、枳殼、木香、檀香理氣和胃、調中止痛，沉香、柴胡、青皮疏肝解郁、降逆止嘔，合為臣藥；延胡索、片姜黃、莪術活血祛瘀、行氣止痛，丁香、高良姜、肉桂溫中散寒止痛，豆蔻、砂仁化濕行氣、溫中止嘔，合為佐藥；甘草調和諸藥，為使藥，諸藥合用，共奏疏肝解郁、開胃消食之功。參考中藥質量標志物確定原則［11-12］，以君藥為主，兼顧臣、佐、使藥，本實驗選取樸沉化郁丸中君藥香附所含α-香附酮，臣藥陳皮、枳殼、青皮所含柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮，佐藥延胡索所含延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿、四氫小檗堿作為指標成分，采用一測多評法，以延胡索乙素為內標，建立與其他成分之間的相對校正因子，并通過耐用性考察、色譜峰定位、外標法測定結果對比，發現該方法操作簡便，穩定性好，可用于該制劑質量評價和控制。