扎沖十三味丸HPLC 指紋圖譜建立及4 種成分測定

馬瑞麗 李錦田 馬桂芝

（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 新疆 烏魯木齊830011）

扎沖十三味丸是新疆博爾塔拉蒙古自治州蒙醫(yī)醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由訶子、制草烏、石菖蒲、木香等13 味藥材組成，功效祛風(fēng)通竅、舒筋活血、鎮(zhèn)靜安神，用于半身不遂、左癱右瘓、口眼歪斜、四肢麻木、腰腿不利、言語不清、筋骨疼痛、神經(jīng)麻痹［1-3］，對肩周炎氣滯血瘀癥也有確切的療效［4］。

中藥指紋圖譜是采用現(xiàn)代分析檢測技術(shù)，從中藥物質(zhì)基礎(chǔ)角度出發(fā)，系統(tǒng)、整體、穩(wěn)定地表征其共有成分及內(nèi)在特征，在全面反映復(fù)雜體系的同時(shí)還能提供豐富的鑒別信息，能客觀地從整體上評價(jià)中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量［4-8］。扎沖十三味丸現(xiàn)行醫(yī)院藥品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)僅限于性狀、鑒別、檢查項(xiàng)，故本實(shí)驗(yàn)建立該制劑HPLC 指紋圖譜，并測定其中沒食子酸、鞣花酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含有量，以期保證臨床用藥安全性和有效性，為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AD 高效液相色譜儀（日本島津公司）；New Classic MS 電子分析天平（0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q 艾柯超純水儀（美國密理博公司）。

1.2 藥物與試劑 沒食子酸、鞣花酸、木香烴內(nèi)酯對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為YA0505YA14、S02N7G24008、Z23M8S36648，純度均≥98%）；去氫木香內(nèi)酯對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-18101301，純度99.20%）；扎沖十三味丸（新疆維吾爾自治區(qū)博爾塔拉州蒙醫(yī)醫(yī)院，批號分別為 20180820、20180917、20181018、20190219、20190326、20190418、20190515、20190611、20190719、20190812）；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 指紋圖譜建立

2.1.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A） -水（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A；10～70 min，10%～35%A；70～95 min，35% A；95～100 min，35%～33% A；100～105 min，33%A；105～115 min，33%～46%A；115～130 min，46%A；130～135 min，46%～42%A；135～160 min，42%A；160～170 min，42%～10%A）；體積流量1 mL／min；柱溫40℃；檢測波長225 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯對照品適量，甲醇制成兩者質(zhì)量濃度分別為220、168 μg／mL 的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取丸劑適量，研細(xì)，過40目篩，精密稱取細(xì)粉1 g，置于25 mL 量瓶中，精密加入20 mL 甲醇，封口，超聲處理30 min，放冷，甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，取上清液，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一批丸劑（批號20181018），按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，以12 號峰（木香烴內(nèi)酯） 為參照峰，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD＜0.3%，相對峰面積RSD＜3%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批丸劑（批號20181018） 6 份，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以12 號峰（木香烴內(nèi)酯） 為參照峰，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD ＜0.4%，相對峰面積RSD＜3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批丸劑（批號20181018），按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD＜0.3%，相對峰面積RSD＜3%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 相似度評價(jià) 取10 批丸劑，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”（2012A 版） 進(jìn)行峰匹配，得到指紋圖譜（圖1），中位數(shù)法生成對照圖譜（圖2），相似度（表1） 均大于0.980。HPLC 指紋圖譜中有13個(gè)共有峰，通過與對照品色譜圖保留時(shí)間及全波長紫外掃描圖譜比對，確定12 號峰為木香烴內(nèi)酯，13 號峰為去氫木香內(nèi)酯。

表1 10 批樣品相似度Tab.1 Similarities of ten batches of samples

2.2 4 種成分含有量測定

2.2.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)［9-14］。Agilent SBC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，5%～10% A；10～14 min，10%～46% A；14～25 min，46%A；25～30 min，46%～70% A；30～45 min，70%A；45～50 min，70%～5% A）；體積流量1 mL／min；柱溫30℃；檢測波長225 nm；進(jìn)樣量10 μL，色譜圖見圖3。由此可知，各成分均與相鄰色譜峰分離度良好，理論塔板數(shù)均大于5 000，陰性無干擾。

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints for ten batches of samples

圖2 各成分對照圖譜Fig.2 Reference chromatogram of various constituents

圖3 各成分HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸、鞣花酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯對照品適量，加甲醇制成四者質(zhì)量濃度分別為164、83、34、40 μg／mL的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取丸劑適量，研細(xì)，過40目篩，精密稱取細(xì)粉0.25 g，置于25 mL 量瓶中，精密加入20 mL甲醇，封口，超聲處理30 min，放冷，甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，取上清液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液制備 按丸劑處方比例及工藝制備不含訶子、木香的陰性樣品，精密稱取0.25 g 至25 mL 量瓶中，精密加入20 mL 甲醇，封口，超聲處理30 min，放冷，甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，取上清液，即得。

2.2.5 方法學(xué)考察

2.2.5.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2” 項(xiàng)下對照品溶液，依次倍量稀釋，分別精密吸取10 μL，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸方程，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.2.5.2 精密度試驗(yàn) 取同一批丸劑（批號20181018），按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得沒食子酸、鞣花酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯峰面 積 RSD 分別為 0.63%、0.43%、0.76%、1.23%，表明儀器精密度良好。

2.2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批丸劑（批號20181018），按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，常溫下于0、2、4、6、9、12 h 在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得沒食子酸、鞣花酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯峰面積RSD 分別為0.57%、0.62%、0.79%、0.28%，表明溶液在室溫下12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批丸劑（批號20181018），按“2.2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得沒食子酸、鞣花酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含有量 RSD 分別為 1.76%、2.18%、1.51%、0.81%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6 份各成分含有量已知的丸劑細(xì)粉，加入各對照品溶液適量，按“2.2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.2.5.6 樣品含有量測定 精密稱取10 批丸劑細(xì)粉，每批0.25 g，按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，平行3 份，計(jì)算含有量，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 扎沖十三味丸中訶子具有澀腸止瀉、斂肺止咳等功效，其中沒食子酸、鞣花酸含有量較高［15-17］；木香具有行氣止痛、健脾消食的作用，其中木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含有量較高［18-19］，故本實(shí)驗(yàn)以上述四者作為指標(biāo)成分。該制劑作為經(jīng)典蒙藥成方制劑，療效明確，相關(guān)研究［9，20-24］大多是在同一色譜條件下測定1～2 種成分含有量，或者在多種色譜條件下測定多種化學(xué)成分；本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上建立了同一色譜條件下同時(shí)測定上述4 種成分含有量的HPLC 法，有助于全面控制其質(zhì)量，節(jié)省時(shí)間和成本。

表4 各成分含有量測定結(jié)果（μg／g， n＝3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（μg／g， n＝3）

3.2 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測器進(jìn)行全波長掃描時(shí)發(fā)現(xiàn)，沒食子酸、鞣花酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯均在225 nm 處有較好吸收，故選擇其作為檢測波長。考察乙腈-水梯度洗脫、甲醇-水等度洗脫、甲醇-0.1% 磷酸梯度洗脫對檢測結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%磷酸梯度洗脫時(shí)極性相差較大的4 種成分均被檢出，而且峰型、分離度、保留時(shí)間較理想。再考察了不同柱溫（25、30、35℃），發(fā)現(xiàn)30℃下各成分與相鄰峰分離度最高。

3.3 HPLC 指紋圖譜分析 本實(shí)驗(yàn)采取“指紋圖譜＋多指標(biāo)成分含有量測定” 模式，對扎沖十三味丸進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)，發(fā)現(xiàn)10 批樣品相似度均大于0.98，4 種成分含有量比較接近，表明該制劑整體質(zhì)量一致性較好。同時(shí)，該方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，能較全面地反映扎沖十三味丸所含成分的種類及其內(nèi)在品質(zhì)，可用于其質(zhì)量控制。