茵陳清筋顆粒質量標準的研究

陸 杰 王婷婷 陳 穎 王新宏 安 叡* 趙 誠*

（1.上海中醫藥大學中藥學院， 上海201203； 2.上海中醫藥大學附屬上海市中西醫結合醫院， 上海200082）

茵陳清筋顆粒由茵陳、垂盆草、蒲公英、拳參、梔子等8 味藥材組成，方中茵陳、垂盆草清熱利濕，解毒消癰，為君藥；拳參、蒲公英、梔子清熱解毒，消腫止痛，為臣藥；大黃通利大便，導熱下行，為佐藥；薏苡仁、甘草健脾滲濕，調和諸藥，為使藥，臨床上用于治療糖尿病足壞疽，緩解足部筋膜感染癥狀。

現代藥效學研究表明，茵陳中綠原酸具有抗氧化、抗菌、抑制糖尿病等作用［1-4］，綠原酸也是茵陳清筋顆粒中垂盆草、梔子、拳參、蒲公英的共有成分；梔子含有環烯醚萜、萜類、有機酸類等成分，其中梔子苷在治療糖尿病方面療效顯著［5］；拳參中沒食子酸有抑菌活性，同時還有抗糖尿病作用［6］；臣藥蒲公英所含成分主要為黃酮類、萜類、有機酸等，具有廣譜抑菌、抗氧化、降糖作用，其中咖啡酸有抗炎、鎮痛、抗菌等作用，能促進傷口愈合［7-8］。

由于中藥復方制劑成分復雜，單一指標不能體現其功效，故多指標測定能更好地評價其質量［9］。目前，尚無對茵陳清筋顆粒質量評價的報道，故本實驗對該制劑中茵陳、垂盆草、梔子、拳參、大黃、甘草、蒲公英進行TLC 鑒別，并通過HPLC法同時測定沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、梔子苷的含有量，以期為其質量控制提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器 TLC Visualizer、Automatic TLC Sampler 4 全自動點樣儀（瑞士Camag 公司）；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；LD-UPW-10 超純水機（上海礫鼎水處理設備有限公司）；R206 旋轉蒸發器（上海申生科技有限公司）；Agilent 1260 HPLC 色譜儀（美國Agilent公司）；SB-5200D 超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；XS105 分析天平（0.01 mg）、ME 204 分析天平（0.1 mg）（瑞士Mettler-Toledo 公司）；薄層層析用硅膠G、硅膠H、1%氫氧化鈉硅膠G 薄層板（煙臺市化學工業研究所）。

1.2 藥物與試劑 梔子苷（批號B21661，純度≥98%）、咖啡酸（批號B20660，純度≥98%）、甘草酸單銨鹽（批號B20418，純度≥98%） 對照品均購自上海源葉生物科技有限公司；綠原酸（批號0753-200111，純度96.8%）、沒食子酸（批號110831-200302，純 度91.5%）、大黃酸（批號0757-9703，純度99.3%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。茵陳（批號120950-201608）、垂盆草（批號 121434-201203）、梔 子（批號120986-201610）、拳參（批號121569-201602）、大黃（批號120984-201202）、甘草（批號121303-201704）、蒲公英（批號121195-201503） 對照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院。茵陳清筋顆粒（批號180312、180321、180329） 由上海中醫藥大學附屬上海市中西醫結合醫院自制。乙腈為色譜純，購自迪馬科技（天津） 有限公司；石油醚、乙酸乙酯、丙酮等試劑均為分析純，購自上海阿達瑪斯試劑有限公司；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 TLC 定性鑒別

2.1.1 茵陳 取顆粒1 g，加入10 mL 甲醇，超聲處理30 min，濾過，蒸干，加入2 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液；取茵陳原藥材、對照藥材各0.1 g，同法制成藥材溶液；取按顆粒處方工藝制備的缺茵陳陰性樣品1 g，同法制成陰性樣品溶液。吸取上述4 種溶液各4 μL，點樣于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90℃） -乙酸乙酯-丙酮（6∶3.5∶0.5） 為展開劑，展開，置于365 nm 紫外燈下檢視，結果見圖1。由此可知，顆粒在藥材色譜圖同一位置上顯相同顏色的特征斑點，陰性無干擾。

圖1 茵陳TLC 色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of Artemisiae scopariae Herba

2.1.2 垂盆草 取顆粒6 g，加入20 mL 甲醇，超聲處理30 min，濾過，蒸干，加入5 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液；取垂盆草原藥材、對照藥材各0.6 g，同法制成藥材溶液；取按顆粒處方工藝制備的缺垂盆草陰性樣品6 g，同法制成陰性樣品溶液。吸取上述4 種溶液各4 μL，點樣于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯（20∶1） 為展開劑，展開，以5%磷鉬酸乙醇溶液為顯色劑，加熱到105℃至斑點顯色清晰，結果見圖2。由此可知，顆粒在藥材色譜圖同一位置上顯相同顏色的特征斑點，陰性無干擾。

圖2 垂盆草TLC 色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of Sedi Herba

2.1.3 梔子 取顆粒3 g，加入10 mL 50%甲醇，超聲處理40 min，濾過，作為供試品溶液；取梔子原藥材、對照藥材各0.2 g，同法制成藥材溶液；取梔子苷對照品適量，加入乙醇制成每1 mL 含4 mg該成分的對照品溶液；取按顆粒處方工藝制備的缺梔子陰性樣品3 g，同法制成陰性樣品溶液。吸取上述5 種溶液各2 μL，點樣于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（5∶5∶1∶1）為展開劑，展開，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，加熱到110℃至斑點顯色清晰，結果見圖3。由此可知，顆粒在藥材色譜圖同一位置上顯相同顏色的特征斑點，陰性無干擾。

圖3 梔子TLC 色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of Gardeniae Fructus

2.1.4 拳參 取顆粒3 g，加入10 mL 甲醇，超聲處理20 min，濾過，作為供試品溶液；取拳參原藥材、對照藥材各0.2 g，同法制成藥材溶液；取按顆粒處方工藝制備的缺拳參陰性樣品3 g，同法制成陰性樣品溶液。吸取上述4 種溶液各5 μL，點樣于同一硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷-丙酮（3∶2） 為展開劑，展開，以5%香草醛硫酸溶液為顯色劑，加熱到110℃至斑點顯色清晰，結果見圖4。由此可知，顆粒在藥材色譜圖同一位置上顯相同顏色的特征斑點，陰性無干擾。

圖4 拳參TLC 色譜圖Fig.4 TLC chromatogram of Bistortae Rhizoma

2.1.5 大黃 取顆粒4 g，加入20 mL 甲醇冷浸1 h，濾過，取濾液5 mL，蒸干后加10 mL 水溶解，再加1 mL 鹽酸，加熱回流30 min，冷卻，20 mL乙醚振搖提取2 次，合并蒸干后加1 mL 三氯甲烷溶解，作為供試品溶液；取大黃原藥材、對照藥材各0.1 g，同法制成藥材溶液；取大黃酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 該成分的對照品溶液；取按顆粒處方工藝制備的缺大黃陰性樣品4 g，同法制成陰性樣品溶液。吸取上述5 種溶液各4 μL，點樣于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠H 薄層板上，以石油醚-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1） 上層溶液為展開劑，展開，置于365 nm紫外燈下檢視，結果見圖5。由此可知，顆粒在藥材色譜圖同一位置上顯相同顏色的特征斑點，陰性無干擾。

2.1.6 甘草 取顆粒20 g，加入100 mL 甲醇加熱回流1 h，蒸干后加40 mL 水溶解，正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，20 mL 蒸餾水洗滌2 次，蒸干正丁醇液，加1 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液；取甘草原藥材、對照藥材各0.6 g，同法制成藥材溶液；取甘草酸單銨鹽對照品適量，加入甲醇制成每1 mL 含2 mg 該成分的對照品溶液；取按顆粒處方工藝制備的缺甘草陰性樣品20 g，同法制成陰性樣品溶液。吸取上述5 種溶液各4 μL，點樣于同一含1%氫氧化鈉溶液的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2） 為展開劑，展開，置于254 nm 紫外燈下檢視，結果見圖6。由此可知，顆粒在藥材色譜圖同一位置上顯相同顏色的特征斑點，陰性無干擾。

圖5 大黃TLC 色譜圖Fig.5 TLC chromatogram of Rhei Radix et Rhizoma

圖6 甘草TLC 色譜圖Fig.6 TLC chromatogram of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

2.1.7 蒲公英 取顆粒3 g，加入20 mL 甲醇，超聲處理20 min，濾過，作為供試品溶液；取蒲公英原藥材、對照藥材各0.2 g，同法制成藥材溶液；取按顆粒處方工藝制備的缺蒲公英陰性樣品3 g，同法制成陰性樣品溶液。吸取上述4 種溶液各6 μL，點樣于同一硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（9∶6.5∶1.5） 為展開劑，展開，晾干，置于365 nm 紫外燈下檢視，結果見圖7。由此可知，顆粒在藥材色譜圖同一位置上顯相同顏色的特征斑點，陰性無干擾。

圖7 蒲公英TLC 色譜圖Fig.7 TLC chromatogram of Taraxaci Herba

2.2 含有量測定（HPLC 法）

2.2.1 色譜條件 Ultimate XB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，2%～5% A；10～20 min，5%～11%A；20～35 min，11～13%A）；體積流量1 mL／min；檢測波長254 nm；柱溫30℃；進樣量10 μL。

2.2.2 溶液制備

2.2.2.1 對照品溶液 精密稱取沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、梔子苷對照品適量，甲醇稀釋成101.6、249.4、13.84、396.9 μg／mL，即得。

2.2.2.2 供試品溶液 精密稱取顆粒2 g，精密加入50 mL 50%甲醇，稱定質量，冷浸1 h，超聲處理30 min，冷卻，甲醇補足減失的質量，續濾液經0.45 μm 微孔過濾，即得。

2.2.2.3 陰性樣品溶液 按處方量制備各成分的陰性樣品，其中缺綠原酸的是除去茵陳、垂盆草、拳參、梔子、蒲公英后制得，缺咖啡酸的是除去茵陳、蒲公英、梔子、拳參后制得，缺沒食子酸的是除去大黃、拳參后制得，缺梔子苷的是除去梔子后制得，按“2.2.2.2” 項下方法制備，即得。

2.2.3 系統適應性試驗 取“2.2.2” 項下各溶液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖8。由此可知，沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、梔子苷與其他成分均達到基線分離，分離度均大于1.5，理論塔板數均不低于10 000，陰性無干擾。

圖8 各成分HPLC 色譜圖Fig.8 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2.2.1” 項下對照品溶液1.0、2.5、5.0、7.5 mL 于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.2.1” 項下對照品溶液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、梔子苷峰面積RSD 分別為0.83%、0.92%、1.2%、0.65%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 取顆粒（批號180312），按“2.2.2.2” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、梔子苷含有量RSD 分別為1.3%、1.2%、1.6%、1.4%，表明該方法重復性良好。

2.2.7 穩定性試驗 取“2.2.2.2” 項下供試品溶液（批號180312），室溫下于0、4、8、12、18、24 h 在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、梔子苷峰面積RSD 分別為0.59%、0.79%、1.3%、0.77%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取6 份含有量已知的顆粒（批號180312），每份1.0 g，加入對照品溶液（沒食子酸、綠原酸、咖啡酸含有量分別為0.473、1.666、0.076 74 mg／mL） 和梔子苷對照品，按“2.2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.2.9 樣品含有量測定 精密稱取3 批顆粒，按“2.2.2.2” 項下方法制 備供試品溶 液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結果見表3。

表3 各成分含有量測定結果（mg／g， n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝3）

3 討論

3.1 TLC 鑒別 本實驗考察了2015 年版《中國藥典》 茵陳鑒別項下TLC 條件，發現陰性樣品中均有干擾，故對展開劑種類進行摸索，選擇石油醚（60～90℃） -乙酸乙酯-丙酮（6∶3.5∶0.5、5∶3∶2）、乙酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶2.5）［10-11］，以石油醚（60～90℃） -乙酸乙酯-丙酮（6∶3.5∶0.5） 為展開劑時，在365 nm 紫外燈下檢視發現顆粒與茵陳對照藥材于相同位置上顯同一橘紅色斑點，陰性無干擾。

在垂盆草TLC 鑒別時，本實驗考察了不同比例環己烷-乙酸乙酯（20∶ 1、25∶ 1、30∶1）［12-13］，發現以20∶1 比例展開、以5%磷鉬酸乙醇溶液為顯色劑時，色譜圖上斑點Rf值合理。

3.2 含有量測定

3.2.1 提取溶劑選擇 本實驗選擇50%、75%、100%甲醇作為提取溶劑，發現50%甲醇提取率較高，所測成分極性較大，易溶于水，而且提取溶劑中水的比例升高有利于其提取，故選擇50% 甲醇作為提取溶劑。

3.2.2 流動相選擇 根據文獻［14-17］報道，本實驗選擇甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.4%磷酸，發現以乙腈-0.1% 磷酸為流動相梯度洗脫時，各成分分離效果較好，峰形理想，同時基質干擾小。

3.2.3 檢測波長選擇 根據2015 年版《中國藥典》［18］和文獻［19-20］報道，梔子苷檢測波長為238 nm，而綠原酸、咖啡酸均為254 nm，沒食子酸為272 nm。綜合考慮，選擇在254 nm 波長處進行測定，此時各成分均有較好的吸收。

4 結論

本實驗建立了茵陳清筋顆粒的質量標準，能清晰分辨各藥材特征斑點，同時含有量測定方法簡便快速，重復性好，結果準確可靠，可為該制劑質量控制提供依據。