玉屏風(fēng)水煎劑及其組分對(duì)大鼠腎臟組織及HEK-293 細(xì)胞OAT1／3 表達(dá)的影響

聞澤強(qiáng) 李大朗 宋 玨

（安徽醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 安徽 合肥230032）

復(fù)方玉屏風(fēng) 出自宋代醫(yī)家張松的《究原方》，全方由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)3 味中藥組成，其主要作用為益氣固表止汗、增強(qiáng)免疫［1］。現(xiàn)多用于治療變應(yīng)性鼻炎、上呼吸道感染等因表虛不固而染風(fēng)邪的患者，及支氣管哮喘、慢性蕁麻疹等因感染風(fēng)邪而至病況反復(fù)發(fā)作的患者，甚至用于治療因傷風(fēng)感冒而誘致腎小球腎炎病況反復(fù)的患者［2-3］。

OATs 屬于溶質(zhì)載體超家族SLC22，主要是分布在腎小管上皮細(xì)胞基底膜側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，有機(jī)陰離子（OAs） 可以通過(guò)其轉(zhuǎn)運(yùn)功能被近端小管上皮細(xì)胞從血液中吸收［4-5］。OATs 轉(zhuǎn)運(yùn)功能是腎臟排泄機(jī)制中非常重要的一步，許多種藥物都是通過(guò)OATs 蛋白經(jīng)腎臟排泄［6-7］。在這一排泄過(guò)程中，藥物可能因?yàn)镺ATs 表達(dá)量或活性受到改變而蓄積在體內(nèi)或者使其排泄加快，從而改變療效和毒副作用；抑或是幾種藥物相互競(jìng)爭(zhēng)OATs 而發(fā)生藥物之間的拮抗作用影響機(jī)體［8-9］。本課題前期實(shí)驗(yàn)［10］表明，玉屏風(fēng)水煎劑中某些組分可能通過(guò)抑制黃芪甲苷的排泄，而使其相較于黃芪水煎劑有更好的抗炎免疫作用。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠及HEK-293 細(xì)胞探討玉屏風(fēng)及其組分對(duì)OAT1／3 基因及蛋白表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD 大鼠，雄性，普通級(jí)，體質(zhì)量（225±30） g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（皖） 2017-006。所有的動(dòng)物均處在穩(wěn)定舒適的環(huán)境中生存，室溫控制在25℃左右，相對(duì)濕度維持在40%～60%，光照周期12 h／12 h，進(jìn)食及飲水自由，飼養(yǎng)1 周后用于實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的福利要求均符合相關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理的要求。

1.2 細(xì)胞株 HEK-293 細(xì)胞（貨號(hào)SE0059，ACTT 細(xì)胞庫(kù)） 購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司，具有穩(wěn)定表達(dá)OAT1／3 蛋白的功能，用含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 藥物與試劑黃芪飲片Astragalus membranaceus（Fisch） Beg、白術(shù)飲片（炒）Atractylodes macrocephalaKoidz.及防風(fēng)飲片Saposhnikovia divaricata（Turcz.） Schischk 均購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院研究員吳婷妮鑒定為正品；DMSO（貨號(hào)MFCD00002089）、MTT（貨號(hào)EZ2411A401） 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；全蛋白提取試劑盒（強(qiáng)）（貨號(hào)BC3710100T） 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)G2026） 購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司；預(yù)染蛋白Marker（貨號(hào)26616）、TRIzol Reagent（貨號(hào)15596） 購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司；β-actin 抗體（貨號(hào)AV0402）、OAT1 抗體（貨號(hào)AB08214578）、OAT3抗體（貨號(hào)AE081010） 購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；二抗（山羊抗兔，貨號(hào)133599）、二抗（山羊抗鼠，貨號(hào)133499） 購(gòu)自北京中山金橋生物有限公司；ECL 超敏化學(xué)發(fā)光液（貨號(hào)161204-34，美國(guó)Advansta 公司）；PrimeScriptTMRT Master Mix 試劑盒（貨號(hào)RR036Q）、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（貨號(hào)RR820 A） 購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京） 有限公司。

1.4 儀器 Mini-PROTEAN Tetra 垂直電泳槽、PowerPacTMBasic 電泳儀電源、Bioshine ChemiO 4600 電泳儀電源、CFX ConnectTM熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Ead 公司；Multiskan MK3 酶標(biāo)儀、TE Thermo Cycle 逆轉(zhuǎn)錄儀均購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司。

2 方法

2.1 藥物制備 參考本課題組前期實(shí)驗(yàn)方法［10］，將黃芪、白術(shù)、防風(fēng)按照3∶1∶1（60 g∶20 g∶20 g） 比例混合，加入6 倍體積超純水，浸泡1 h，加熱煮至沸，用文火繼續(xù)煎煮40 min，趁熱用雙層紗布過(guò)濾；收集濾渣，加入4 倍體積超純水按相同的方法繼續(xù)煎煮1 次；整合2 次濾液，加中火繼續(xù)煎煮成濃縮液，最后將藥液定量至質(zhì)量濃度為2 g 生藥／mL（玉屏風(fēng)水煎劑） 藥液。用相同的方法分別制備黃芪、白術(shù)、防風(fēng)水煎劑（各組水煎劑最終質(zhì)量濃度為1.2 g 生藥／mL）。

2.2 分組及給藥 將大鼠分為正常組、玉屏風(fēng)組（10 g 生藥／kg）、白術(shù)組（6 g 生藥／kg）、防風(fēng)組（6 g 生藥／kg）、黃芪組（6 g 生藥／kg），每組6只，灌胃給藥1 次／d，連續(xù)給藥21 d。取腎臟保存。

2.3 MTT 實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［11］。將細(xì)胞懸液接種在96 孔板（100 μL／孔，0.5×104～1×104／孔），邊加細(xì)胞懸液邊吹打以確保每孔細(xì)胞數(shù)均等，培養(yǎng)6 h 貼壁，各組給予不同質(zhì)量濃度藥物（0、50、60、70、80、90、100 mg 生藥／mL），藥物處理24 h；每孔加入20 μL MTT，避光孵育4 h，棄去上清液；每孔加入150 μL DMSO，放置搖床上震蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處OD，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔取平均值進(jìn)行計(jì)算。細(xì)胞存活率＝［（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組） ／（OD對(duì)照組-OD空白組）］×100%。

2.4 Western blot 法檢測(cè)OAT1／3 蛋白表達(dá) 參考文獻(xiàn)［12］。大鼠腎臟及細(xì)胞樣品總蛋白的提取按照全蛋白提取試劑盒步驟進(jìn)行提取，采用BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行定量。配置10% 分離膠和5% 濃縮膠進(jìn)行電泳，80 V 恒壓電泳30 min，電壓120 V 電 泳70 min；轉(zhuǎn)膜設(shè)置為200 mA恒流；一抗（OAT1 為3∶7 000，OAT3 為3∶7 000，β-actin 為1∶4 000） 孵育過(guò)夜，次日加入二抗（1∶4 000） 孵育1 h，最后放置于凝膠成像儀內(nèi)發(fā)光采圖，通過(guò)Image-Pro Plus 6.0 測(cè)定其灰度值，采用β-actin 作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量比較。

2.5 RT-PCR 法檢測(cè)OAT1／3 mRNA 表達(dá) 參考文獻(xiàn)［13］。大鼠腎臟及細(xì)胞總RNA 的提取按照RNA 提取試劑盒進(jìn)行提取，使用Nanodrop 2000 檢測(cè)RNA 的濃度及純度。按照PrimeScriptTMRT Master Mix 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為37℃、14 min，85℃、30 s，1個(gè)循環(huán)。PCR 反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10 μL，所需正反向引物各加入0.3 μL，無(wú)酶水1.4 μL，cDNA 3 μL，TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 5 μL；所需引物序列如表1，每個(gè)待檢基因重復(fù)做3個(gè)反應(yīng)孔。PCR 反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，然后進(jìn)入循環(huán)階段，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性15 s，60℃退火60 s，60℃延伸到95℃，每15 s 升溫0.3℃，共40個(gè)循環(huán)。組織RNA 以GAPDH作為內(nèi)參，細(xì)胞RNA 則以ACTB作為內(nèi)參，用2-△△ct方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism7 軟件來(lái)分析，數(shù)據(jù)以（） 來(lái)表示，多組間比較采用方差分析，以P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度藥物對(duì)HEK-293 細(xì)胞存活率的影響 如表2 所示，隨著各藥物濃度增加HEK-293細(xì)胞存活率逐漸下降，黃芪、白術(shù)24 h 安全給藥濃度為0～60 mg 生藥／mL，玉屏風(fēng)組、防風(fēng)組24 h安全給藥濃度為0～70 mg 生藥／mL。

表2 不同濃度藥物對(duì)HEK-293 細(xì)胞存活率的影響（n＝3）Tab.2 Effects of different concentrations of drugs on the survival rate of HEK-293 cells（n＝3）

3.2 玉屏風(fēng)水煎劑對(duì)HEK-293 細(xì)胞OAT1／3 蛋白表達(dá)的影響 如圖1 所示，與正常組比較，玉屏風(fēng)、白術(shù)、防風(fēng)水煎劑能抑制HEK-293 細(xì)胞OAT1蛋白表達(dá)（P＜0.01），黃芪水煎劑促進(jìn)HEK-293細(xì)胞OAT1 蛋白表達(dá)（P＜0.01），并且玉屏風(fēng)組相較于黃芪組OAT1 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）；與正常組比較，玉屏風(fēng)、防風(fēng)水煎劑能抑制HEK-293細(xì)胞OAT3 蛋白表達(dá)（P＜0.01），白術(shù)、黃芪水煎劑能促進(jìn)OAT3 蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），并且玉屏風(fēng)組相較于黃芪組OAT3 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）。

3.3 玉屏風(fēng)水煎劑對(duì)HEK-293 細(xì)胞OAT1／3 mRNA 表達(dá)的影響 如圖2 所示，與正常組比較，玉屏風(fēng)、白術(shù)、防風(fēng)水煎劑能抑制HEK-293 細(xì)胞OAT1 mRNA 表達(dá)（P＜0.01），玉屏風(fēng)、防風(fēng)水煎劑能抑制 HEK-293 細(xì) 胞OAT3 mRNA 表 達(dá)（P＜0.05），白術(shù)、黃芪水煎劑能促進(jìn)HEK-293 細(xì)胞OAT3 mRNA 表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）；與黃芪組相比較，玉屏風(fēng)組OAT1／3 mRNA 表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.001）。

3.4 玉屏風(fēng)水煎劑對(duì)大鼠腎組織中OAT1／3 蛋白表達(dá)的影響 如圖3 所示，與正常組比較，玉屏風(fēng)、防風(fēng)、白術(shù)水煎劑抑制大鼠腎組織OAT1 蛋白表達(dá)（P＜0.05），玉屏風(fēng)組相較于黃芪組OAT1 蛋白表達(dá)下降（P＜0.01）；與正常組比較，玉屏風(fēng)水煎劑抑制大鼠腎組織OAT3 蛋白表達(dá)（P＜0.05），而白術(shù)水煎劑促進(jìn)大鼠腎組織OAT3 蛋白表達(dá)（P＜0.01）。

3.5 玉屏風(fēng)水煎劑對(duì)大鼠腎組織中OAT1／3 mRNA表達(dá)的影響 如圖4 所示，與正常組比較，玉屏風(fēng)、防風(fēng)、白術(shù)水煎劑抑制大鼠腎組織OAT1mRNA 表達(dá)（P＜0.01）：玉屏風(fēng)、防風(fēng)水煎劑抑制大鼠腎組織OAT3 mRNA 表達(dá)（P＜0.01），而白術(shù)水煎劑促進(jìn)大鼠腎組織OAT3 mRNA 表達(dá)（P＜0.01）。與黃芪組比較，玉屏風(fēng)組OAT1／3 mRNA 表達(dá)下降（P＜0.01）。

圖2 玉屏風(fēng)及水煎劑對(duì)HEK-293 細(xì)胞OAT1／3 mRNA表達(dá)的影響（n＝3）Fig.2 Effects of YPFD on the expression of OAT1／3 mRNA in HEK-293 cells（n＝3）

4 討論

方劑配伍是中醫(yī)臨床治療疾病的主要用藥方式，臨床實(shí)踐表明，中藥復(fù)方往往會(huì)比單一的中藥材產(chǎn)生更好的療效和更低的毒性作用［14-15］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究［10］顯示，白術(shù)＋黃芪配伍組相較于黃芪組用藥，能明顯增加其主要成分黃芪甲苷在大鼠體內(nèi)AUC、t1／2，降低黃芪甲苷的清除率。提示這種由藥物相互作用引起的藥動(dòng)學(xué)的改變可能與黃芪甲苷體內(nèi)排泄有關(guān)。由黃芪甲苷的結(jié)構(gòu)解析可以判斷黃芪甲苷在體內(nèi)可能以陰離子的形式存在，有研究［16］表明，腎臟排泄是黃芪甲苷的重要排泄途徑，協(xié)同效應(yīng)可能與黃芪甲苷腎臟排泄過(guò)程的變化有關(guān)。OAT1／3 蛋白在調(diào)節(jié)腎臟排泄及內(nèi)源性和外源性有機(jī)陰離子（包括各種藥物及其代謝物）的再吸收方面起著很重要的作用。因此本課題考察了玉屏風(fēng)及其組分黃芪、白術(shù)、防風(fēng)水煎劑對(duì)大鼠腎臟及HEK-293 細(xì)胞中OATs 的2個(gè)亞型OAT1 和OAT3 的蛋白和基因表達(dá)的影響。

圖3 玉屏風(fēng)水煎劑大鼠腎組織中OAT1／3 蛋白表達(dá)的影響（n＝5）Fig.3 Effects of YPFD on OAT1／3 protein expression in kidney tissue of rats（n＝5）

圖4 玉屏風(fēng)水煎劑對(duì)大鼠腎組織中OAT1／3 mRNA 表達(dá)的影響（n＝5）Fig.4 Effects of YPFD on OAT1／3 mRNA expression in kidney tissue of rats（n＝5）

根據(jù)大鼠腎組織Western blot 結(jié)果顯示，與正常組和黃芪組相比，玉屏風(fēng)組的OAT1／3 蛋白表達(dá)出現(xiàn)顯著降低，這與檢測(cè)OAT1／3 mRNA 表達(dá)結(jié)果相同。而且HEK-293 細(xì)胞中OAT1／3 蛋白及mRNA表達(dá)調(diào)節(jié)作用與動(dòng)物體內(nèi)相似。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合前期藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果足以表明，玉屏風(fēng)可能通過(guò)下調(diào)腎臟中OAT1／3 mRNA 表達(dá)，降低OAT1／3 蛋白表達(dá)，從而減少體內(nèi)黃芪甲苷的腎臟排泄，提高其生物利用度。玉屏風(fēng)和防風(fēng)藥物毒性很低，在一定的劑量使用范圍內(nèi)比較安全，對(duì)OATs 抑制作用顯著，因此，在玉屏風(fēng)、防風(fēng)聯(lián)合其它藥物使用時(shí)，應(yīng)當(dāng)考慮藥物相互作用而產(chǎn)生毒副作用。

玉屏風(fēng)對(duì)有機(jī)陰離子家族OAT1、OAT3 蛋白抑制作用可能與其組方內(nèi)黃芪甲苷生物利用度增高、藥效增強(qiáng)有關(guān)。但它們對(duì)OAT1／3 蛋白和基因所產(chǎn)生抑制作用的機(jī)理尚不明確，以及對(duì)腎臟其它藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響有待更進(jìn)一步研究。