川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響

劉 星 李麗娟 彭莉萍 魏妮娜 劉銀花 許佳偉 黎善銘

（1.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)， 廣東 珠海519041； 2.香洲區(qū)人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 廣東 珠海519040）

隨著預(yù)期壽命的延長(zhǎng)和生活方式的改變，老年性疾病患病率不斷增加，尤其是以認(rèn)知功能減退為主的腦部退行性疾病成為影響老年人健康的主要疾病，是威脅老年人健康的“四大殺手” 之一，并已成為威脅人類(lèi)健康的最嚴(yán)重疾病之一［1］。尋找一種有效減緩其發(fā)展的治療方法，延緩腦衰老、減輕記憶減退和認(rèn)知障礙等是全球亟待解決的問(wèn)題，也是老年醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs） 為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的原始細(xì)胞，具有自我更新、多向分化、遷移的潛能，可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞［2］。神經(jīng)干細(xì)胞移植治療為神經(jīng)再生的治療策略開(kāi)辟了嶄新的研究方向，被譽(yù)為目前神經(jīng)系統(tǒng)損傷最有潛力的治療方式，并在臨床應(yīng)用中取得了一定療效［3］。

川續(xù)斷皂苷Ⅵ（Asperosaponin Ⅵ） 又名木通皂苷D，是從傳統(tǒng)中草藥川續(xù)斷植物的根中提取分離出的三萜皂苷類(lèi)化合物，為川續(xù)斷的主要活性成分。川續(xù)斷皂苷Ⅵ在神經(jīng)保護(hù)、抗細(xì)胞凋亡、心肌保護(hù)、鎮(zhèn)痛等方面的發(fā)揮作用，引起廣大學(xué)者的關(guān)注［4］。川續(xù)斷皂苷Ⅵ神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的研究皆與阿爾茲海默病（Alzheimer’ disease，AD） 有關(guān)。研究表明，川續(xù)斷皂苷Ⅵ可以顯著抑制Aβ 誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減少膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和炎癥因子，有效降低AD 發(fā)病［5］。川續(xù)斷皂苷Ⅵ神經(jīng)保護(hù)機(jī)制與其抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)的發(fā)生以及氧化應(yīng)激有關(guān)［6］。川續(xù)斷皂苷VI 與人參總皂苷具有類(lèi)似的藥理活性，研究顯示人參皂苷對(duì)NSCs 增殖和分化具有促進(jìn)作用［7］。同時(shí)鑒于川續(xù)斷皂苷VI 具有神經(jīng)保護(hù)作用，本研究探討川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)昆明種小鼠，體質(zhì)量（20±2） g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵） 2013-0002。動(dòng)物飼料購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為溫度25～28℃，相對(duì)濕度70%～85%，自然通風(fēng)，光照／黑暗各12 h。

1.2 藥物與試劑 川續(xù)斷皂苷Ⅵ（批號(hào)111685-201605） 購(gòu)自廣州永凱生物科技有限公司；CCK-8試劑（批號(hào)160816） 購(gòu)自廣州速研生物科技有限公 司；B27（批號(hào) 1678168 ）、EGF（批號(hào)1680430）、DMEM／F12（批號(hào)1672580） 購(gòu)自美國(guó)Gibco 公 司；FITC-羊抗兔IgG（批號(hào)L147A）、TRITC-羊抗小鼠IgG（批號(hào)L146A） 購(gòu)自美國(guó)Gene Copoeia 公司；Nestin 單克隆抗體（批號(hào)2370145）、Tubulin 單克隆抗體（批號(hào)2468132） 購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公 司；GFAP 多克隆抗體（批號(hào)A0237）、BrdU 單克隆抗體（批號(hào)A1482）、Actin多克隆抗體（批號(hào)A2319）、caspase-3 多克隆抗體（批號(hào)A19654）、Jagged 1 多克隆抗體（批號(hào)A12754） 購(gòu)自美國(guó)ABclonal 公司；TRIzol（批號(hào)1712036）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)1711282） 購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京） 有限公司；SYBR master mix（批號(hào)1801275） 購(gòu)自諾唯贊生物有限公司。

2 方法

2.1 含藥血清制備 稱(chēng)取100 mg 川續(xù)斷皂苷Ⅵ溶于50 mL 超純水，使終質(zhì)量濃度為2 mg／mL。給藥組小鼠腹腔注射川續(xù)斷皂苷Ⅵ（10 mL／kg），空白對(duì)照組小鼠則腹腔注射超純水，連續(xù)給藥7 d，末次給藥1 h 后摘眼球取血，4℃靜置1～2 h，3 000 r／min離心15 min，取上清用0.22 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩＝o藥組所得的血清為高濃度含藥血清，分別稀釋1、2 倍為中、低濃度含藥血清，空白對(duì)照組取得的血清為空白血清。

2.2 神經(jīng)干細(xì)胞分離與培養(yǎng) 選取13～15 d 孕齡小鼠（SPF 級(jí)昆明種小鼠），頸椎脫臼法處死小鼠，酒精消毒剖開(kāi)腹腔取出胚胎。在D-Hank’s 溶液中剝離胎盤(pán)、胎膜，并用D-Hank’s 漂洗4 次。用手術(shù)刀切取前腦側(cè)腦室周?chē)M織（包含腦室下區(qū)） 于培養(yǎng)皿內(nèi)，加入2 mL 培養(yǎng)基（1% 雙抗、1%B27、0.02%EGF、DMEM 培養(yǎng)基） 吹打制成細(xì)胞懸液，400目篩網(wǎng)過(guò)濾，1 000 r／min 離心5 min，棄上清加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。接種于培養(yǎng)板內(nèi)，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

2.3 神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定、分化、凋亡 取無(wú)菌蓋玻片，置于多聚賴(lài)氨酸中避光包被24 h。使用前用滅菌PBS 漂洗3 次，5 min／次，晾干，平鋪于6 孔板內(nèi)。取神經(jīng)干細(xì)胞懸液滴加在蓋玻片上靜置2 h，分別加入含有10%含藥血清（高、中、低濃度）、空白血清培養(yǎng)基1 mL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。棄除培養(yǎng)基，PBS 漂洗3 次，滴加預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液固定15 min，PBS 漂洗。0.5%Triton X-100 室溫通透20 min，PBS 漂洗。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，PBS 漂洗。滴加一抗（Nestin、BrdU、Tublin 按1∶500 稀釋?zhuān)珿FAP 按1∶200 稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜，PBS 漂洗3 次。滴加FITC 或TRITC 標(biāo)記的二抗（1∶200） 室溫孵育30 min，PBS 洗3 次。滴加DAPI 染核15 min，PBS 漂洗，熒光顯微鏡下觀察［8］。

2.4 CCK-8 法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞增殖 取神經(jīng)干細(xì)胞懸液加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別加入含有10%含藥血清（高、中、低濃度）、空白血清培養(yǎng)基200 μL，培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入10 μL CCK-8 試劑培養(yǎng)4 h，取出輕微振蕩混勻后，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處OD。

2.5 RT-PCR 檢測(cè)基因表達(dá) 加入含有10%含藥血清（高、中、低濃度）、空白血清培養(yǎng)基處理神經(jīng)干細(xì)胞72 h，收集細(xì)胞。參照TRIzol RNA 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用ABI 7500 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 儀檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增程序?yàn)?5 °C 預(yù)變性30 s；95 °C 變性5 s，60 °C 退火延伸34 s，40個(gè)循環(huán)。以Actin作為內(nèi)參，利用2-ΔΔct方法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tabl.1 Primer sequences

2.6 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 加入含有10%含藥血清（高、中、低濃度）、空白血清培養(yǎng)基處理神經(jīng)干細(xì)胞72 h，收集細(xì)胞。提取總蛋白，用BCA 法測(cè)定樣品蛋白濃度，按50 μg 總蛋白量計(jì)算上樣體積。100℃變性10 min，12% SDS-PAGE 電泳1.5 h，250 mA 轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗（Actin、caspase-3、Tublin 按1∶1 000稀釋?zhuān)琂agged1、GFAP 按1∶500 稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜，TBST 漂洗后室溫孵育二抗（1∶10 000）1 h。TBST 再次漂洗后，滴加ECL 超敏發(fā)光液至PVDF 膜上，采用天根成像儀曝光。以Actin 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白灰度值，并將空白對(duì)照組目的蛋白灰度值比定為1，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組中各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)干細(xì)胞鑒定 初期原代神經(jīng)干細(xì)胞呈單個(gè)懸浮狀，表面圓潤(rùn)光滑，透光性強(qiáng)；培養(yǎng)24 h后細(xì)胞開(kāi)始聚集成團(tuán)；72 h 可見(jiàn)神經(jīng)球形成，立體感和折光性強(qiáng)，表面光滑、透亮，表明干細(xì)胞活力良好。經(jīng)免疫熒光法鑒定，Nestin 染色陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色熒光，DAPI 染色后細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。見(jiàn)圖1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)神經(jīng)干細(xì)胞比例達(dá)95%以上，表明該培養(yǎng)體系可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 NSCs 鑒定（×200）Fig.1 NSCs identification（×200）

3.2 川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖影響 不同濃度含藥血清OD450nm與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2。DAPI 核染細(xì)胞呈橢圓形，均勻分布。Brdu 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，占總細(xì)胞數(shù)比例低。與空白對(duì)照組相比，不同濃度含藥血清Brdu 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖3，與CCK-8 檢測(cè)結(jié)果一致。說(shuō)明川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖無(wú)作用。

圖2 MTT 檢測(cè)各組神經(jīng)干細(xì)胞增殖Fig.2 NSCs proliferation in each group by MTT

圖3 Brdu 檢測(cè)各組神經(jīng)干細(xì)胞增殖Fig.3 NSCs proliferation in each group by Brdu

3.3 川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響 免疫熒光染色結(jié)果顯示，神經(jīng)元胞體呈橢圓形或梭形，細(xì)胞體積縮小向核靠攏，突起呈雙極或多級(jí)狀，細(xì)長(zhǎng)的突起交織成網(wǎng)。空白對(duì)照組神經(jīng)元數(shù)量較少，趨向于分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞。不同濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清均能促進(jìn)NSCs 分化，且主要向神經(jīng)元方向分化。與空白對(duì)照組相比，川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清高、中濃度組的神經(jīng)元分化率更高（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

3.4 川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響 經(jīng)DAPI 染色后，凋亡的神經(jīng)干細(xì)胞體積縮小，與周?chē)募?xì)胞脫離，細(xì)胞質(zhì)密度增加，通透性改變，核質(zhì)濃縮，胞質(zhì)明亮。與空白對(duì)照組相比，川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清高濃度組細(xì)胞凋亡率更高（P＜0.05），而低、中濃度組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖5。說(shuō)明川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清高濃度可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，低、中濃度含藥血清不引起細(xì)胞凋亡。

圖4 不同濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對(duì)NSCs 分化的影響Fig.4 Effects of different concentrations of asperosaponin Ⅵmedicated serum on NSCs differentiation

圖5 不同濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對(duì)NSCs 凋亡率的影響Fig.5 Effects of different concentrations of asperosaponin Ⅵmedicated serum on NSCs apoptosis rate

3.5 川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清高、中濃度對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)mRNA 表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組相比，高、中濃度組中Notch1、Tublin、caspase-3 mRNA表達(dá)升高（P＜0.05），Jagged1、Hes1、Sox2、Pax6 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）；高濃度組GFAPmRNA 表達(dá)升高（P＜0.05），中濃度組GFAPmRNA 表達(dá)降低（P＜0.01）；高濃度組Ngn1 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），中濃度組Ngn1 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖6。

3.6 中濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對(duì)GFAP、Tublin，Jagged1、caspase-3 蛋白表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，中濃度組Tublin 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），GFAP、Jagged1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)圖7，與基因表達(dá)的結(jié)果一致。說(shuō)明川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清中濃度NSCs 向神經(jīng)元方向分化較多，而向膠質(zhì)細(xì)胞分化較少，與Jagged1 的表達(dá)水平降低密切相關(guān)。caspase-3 蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清中濃度對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)作用。

圖6 川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清高、中濃度對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)mRNA 表達(dá)的影響Fig.6 Effects of high and medium concentrations of asperosaponin Ⅵmedicated serum on expression of NSCs related mRNA

圖7 中濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對(duì)GFAP、Tublin、Jagged1、caspase-3 蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effects of medium concentration of asperosaponin Ⅵmedicated serum on the relative expression of GFAP，Tublin，Jagged1 and caspase-3

4 討論

許多研究表明，中藥復(fù)方或單體對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化有重要作用。如黃芪甲苷可通過(guò)上調(diào)與細(xì)胞增殖相關(guān)基因Hes1、Hes5、cyclin D1 的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖［9］。姜黃素在體內(nèi)外均能促進(jìn)NSCs 的增殖，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系［10］。人參皂苷Rg1 可在體外誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞增殖并向神經(jīng)元分化［11］。人參Rd 能在體內(nèi)外誘導(dǎo)NSCs 增殖，但對(duì)其分化無(wú)明顯促進(jìn)作用［12］。人參皂苷Rg1、Rd1通過(guò)介導(dǎo)PI3K／Akt 信號(hào)通路促進(jìn)體外培養(yǎng)的NSCs增殖，對(duì)腦缺血再灌注損傷模型的神經(jīng)干細(xì)胞有保護(hù)作用［13-14］。還有研究表明，淫羊藿苷、黃芪多糖、三七總皂苷、銀杏內(nèi)酯B、銀杏提取物、紅花、丹參、刺梨和龜板等中藥單體成分或中藥可明顯促進(jìn)NSCs 增殖，或還可誘導(dǎo)其向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化［15-17］。

鑒于中藥在臨床應(yīng)用中大多以復(fù)方形式進(jìn)行配藥，其化學(xué)成分十分復(fù)雜，藥理作用具有多個(gè)靶點(diǎn)、多層次的特點(diǎn)，且體內(nèi)干擾因素較多。本文采用川續(xù)斷皂苷VI 含藥血清可盡可能的模擬體內(nèi)藥物活性成分與細(xì)胞間相互作用的微環(huán)境，更真實(shí)地反映中藥藥效，實(shí)現(xiàn)中藥體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)反應(yīng)相結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具有客觀性和可靠性［18］。

眾多研究表明，激活Notch 信號(hào)通路會(huì)抑制NSCs 向神經(jīng)元分化，促進(jìn)NSCs 向星型膠質(zhì)細(xì)胞分化，抑制NSCs 向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。阻斷Notch信號(hào)通路，則促進(jìn)NSCs 向神經(jīng)元分化［19-20］。Notch信號(hào)通路的Ngn1 可阻斷干細(xì)胞Jak／STAT 信號(hào)途徑，抑制NSCs 增殖，并誘導(dǎo)神經(jīng)元的生成。而Hes1 可誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)，促進(jìn)干細(xì)胞增殖，抑制NSCs 分化。活化的Notch 信號(hào)通路可以增加Hes1 和Hes5 的表達(dá)，進(jìn)而使細(xì)胞周期蛋白表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)干細(xì)胞增殖［21-22］。本文結(jié)果顯示，高、中濃度含藥血清中Hes1 mRNA 表達(dá)降低，可能是由于配體Jagged1 表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致Notch 信號(hào)通路被抑制引起的。Hes1 mRNA 表達(dá)降低使NSCs 的增殖受到抑制，因此在高、中濃度組中神經(jīng)干細(xì)胞均未見(jiàn)顯著增殖。Ngn1 mRNA 表達(dá)在中濃度組表達(dá)顯著上調(diào)，說(shuō)明中濃度含藥血清誘導(dǎo)Ngn1 mRNA表達(dá)。免疫熒光和免疫印跡檢測(cè)結(jié)果均表明，中濃度組神經(jīng)元比例較高，且Tublin 蛋白表達(dá)升高。表明中濃度含藥血清可能通過(guò)抑制Notch 信號(hào)通路，增強(qiáng)Ngn1 mRNA 表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)NSCs 向神經(jīng)元分化。

Sox2 在發(fā)育早期對(duì)于維持NSCs 的自我更新及多向分化潛能具有關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，可直接作用于GFAP基因而抑制其表達(dá)，對(duì)神經(jīng)元前體細(xì)胞的分化起到至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。Sox2 可以通過(guò)上調(diào)survivin 蛋白表達(dá)而抑制caspase-9 的活性，從而調(diào)控NSCs 的存活，而PI3K／Akt 通路可調(diào)控Sox2的表達(dá)［23］。加入高、中濃度含藥血清后，Sox2 mRNA 表達(dá)顯著降低，可能是由于PI3K／Akt 通路發(fā)生改變引起的。在中濃度組中，GFAPmRNA 和蛋白表達(dá)均顯著降低，可能是由于Sox2 mRNA 表達(dá)下調(diào)引起的，與中濃度含藥血清不能促進(jìn)NSCs向膠質(zhì)細(xì)胞分化的結(jié)果一致。Pax6 參與調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元的分化，可能也參與海馬的發(fā)育過(guò)程中。本文結(jié)果顯示，高、中濃度組其表達(dá)水平顯著降低，說(shuō)明這2 種濃度的含藥血清抑制Pax6 mRNA 表達(dá)。

綜上，高、中濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ含藥血清對(duì)Notch 通路有顯著作用，可抑制配體Jagged1mRNA表達(dá)而阻礙該通路，從而促使NSCs 向神經(jīng)元方向分化。但高濃度含藥血清細(xì)胞毒性作用較大，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率升高。而中濃度含藥血清既可誘導(dǎo)NSCs 向神經(jīng)元分化，又不導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，可望成為治療神經(jīng)退行性疾病備選藥物。