HPLC 法測定不同產地半夏及其偽品中4 種核苷

夏成凱楊葛俊劉耀武*

（1.安徽省中醫藥科學院亳州中醫藥研究所， 安徽 亳州236800； 2.亳州職業技術學院， 安徽 亳州236800； 3.安徽中醫藥大學， 安徽 合肥230031）

半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.） Breit.的塊莖，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結之功效［1］，為臨床常用中藥，主產于甘肅、貴州、湖北等地。

半夏質量的優劣越來越受到人們的關注，其主要藥效成分受到土壤、水分、氣候、光輻射、生物傳播等環境條件的影響，化學成分的含有量差異很大。

目前文獻報道的半夏的化學成分主要為生物堿類、揮發油、核苷類成分［2-5］。吳皓等［5］從半夏中分離得到肌苷被作為其主要指標性成分，核苷類成分具有廣泛的生理活性。

目前有研究［6-7］報道半夏代表性成分的含有量測定主要為生物堿類，部分關于核苷類成分的含有量測定方法［8-11］；許宏亮等［12］通過對半夏皮與塊莖中4 類成分進行分析；阮洪根等［13］則對不同規格中半夏的核苷類成分進行分析。但對于不同產地半夏及其偽品中多種核苷類成分的含有量測定較少，特別是肌苷的含有量測定較少。由于半夏的價格較貴，市場上諸多偽品，如水半夏、天南星等直接影響其質量，主要從性狀、顯微等鑒別方法進行區分，無法實現定量鑒別［14-16］。

為了更好的探索不同產地半夏及其偽品中核苷類成分的含有量，建立多種核苷類成分的檢測方法，更好的區分半夏及其偽品。本實驗分別收集了來自甘肅、貴州、云南、河北、湖北的正品生旱半夏及來源于江西鞭檐犁頭尖生水半夏、天南星、河北掌葉半夏、東北生天南星等，對尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷的含有量進行測定，以期建立快捷、方便、可靠的方法檢測半夏中4 種核苷類成分，為不同產地半夏及其偽品的評價提供參考依據。

1 材料

1.1 儀器 BS200S 電子天平（杭州康納科技有限公司）；Mettlertoledo 電子分析天平（百萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；DL-720D 超聲波清洗器（杭州法蘭特超聲波科技有限公司）；RJ-TGL-16C型高速離心機（成都智楷分離科技有限公司）；UPH-Ⅱ-107型優普超型純水器（西安優普儀器設備有限公司）；皖儀L600 高效液相色譜儀（安徽皖儀科技股份有限公司）。

1.2 試劑與藥物 對照品尿苷（批號170329，純度≥98%）、肌苷（批號161013，純度≥98%）；鳥苷（批號130107，純度≥98%）、腺苷（批號170417，純度≥98%），均購于成都普菲德生物技術有限公司。乙腈（色譜純）；高純水（自制）。

9 批藥材經亳州職業技術學院劉耀武教授鑒定為天南星科植物半夏屬半夏Pinellia ternata（Thunb.） Breit.的干燥塊莖、天南星科犁頭尖屬水半夏Typhonium flagelliforme（Lodd.） Blume.的干燥塊莖、天南星科植物異葉天南星Arisaema heterophyllumBl.的干燥塊莖、天南星科植物半夏屬掌葉半夏Pinellia pedatisecia Schott.的干燥塊莖。信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取尿苷對照品10.108 mg，置于10 mL 量瓶中，加水溶液溶解并定容至刻度，精密量取1 mL 置于100 mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得尿苷對照品溶液。

精密稱取肌苷對照品12.145 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，精密量取1 mL置于100 mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得肌苷對照品溶液。

精密稱取鳥苷對照品16.128 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，精密量取1 mL置于100 mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得鳥苷對照品溶液。

精密稱取腺苷對照品14.682 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，精密量取1 mL置于100 mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得腺苷對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 稱定半夏正品粉末（過3 號篩） 約2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入水20 mL，稱定質量，超聲處理45 min（500 W，40 kHz），冷卻至室溫，再稱定質量，用純水補足減失質量，全部轉移至離心管中，4 000 r／min離心5 min，取上清液1.5 mL，經0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-AqC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -高純水（B），梯度洗脫（0～15 min，100% B；15～20 min，100%～97%B；20～30 min，97%～85%B；30～40 min，85%～80% B；40～50 min，80%～100%B）；檢測波長260 nm；柱溫25℃；體積流量1 mL／min；進樣量20 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 分別精密量取“2.1.1”項下尿苷、肌苷、腺苷對照品溶液0.1、0.5、1、1.5、2.0 mL 置10 mL 量瓶中，用高純水稀釋至刻度，搖勻，得到不同濃度的進樣對照品溶液。分別精密量取“2.1.1” 項下配制的鳥苷對照品溶液1、2、3、5、10 mL 置10 mL 量瓶中，用高純水稀釋至刻度，搖勻，得到不同濃度的鳥苷進樣對照品溶液。在“2.2” 項色譜條件下，分別以上述各對照品溶液進樣，每個濃度進樣3 次，記錄峰面積，取峰面積的平均值。以峰面積為縱坐標（Y），對照品的質量濃度為橫坐標（X） 進行回歸，結果見表2。表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度試驗 分別量取尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷對照品溶液適量，在“2.2” 項色譜條件下進樣，進樣量20 μL，重復6 次，記錄色譜峰面積，RSD（n＝6） 分別為0.16%、0.21%、0.94%、0.06%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取河北產生旱半夏正品樣品6 份，取“2.1.2” 項下供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進樣，記錄色譜峰面積，結果尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷的RSD（n＝6） 分別為0.16%、0.59%、0.43%、0.41%，表示該方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 取來源于河北生半夏供試品溶液，于0、2、4、8、12、16、24 h 在“2.2” 項色譜條件下進樣，記錄峰面積，尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷的RSD（n＝6） 分別為0.05%、0.03%、0.32%、0.27%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 取6 份已知含有量的河北生半夏樣品約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入已知含有量的尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷對照品溶液各1 mL，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進樣，計算加樣回收率。結果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.4 樣品含有量測定 對9 批樣品中4 種不同的核苷類成分尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷進行測定，結果見表4。

表4 各成分含有量測定結果（n＝6，μg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（n＝6，μg／g）

3 結果與討論

3.1 含有量比較 研究結果表明，不同產地的半夏與其偽品中各核苷的含有量差別較大，其中肌苷在貴州、云南產半夏中未檢出；腺苷在貴州、云南產半夏及東北生天南星片中未檢出；鳥苷在湖北產半夏及天南星中未檢出；尿苷在貴州半夏與東北生天南星中未檢出。半夏中4 種核苷總量在12.6～523.80 μg／g 之 間，水半夏中核苷總量為313.19 μg／g，天南星中核苷總量為252.7 μg／g，掌葉半夏核苷總量為1 055.70 μg／g，生天南星片核苷總量為102.5 μg／g。

在采集的半夏樣品中，甘肅產半夏中肌苷、鳥苷、尿苷含有量較其他產地略高。目前市場上所用半夏產地也以甘肅為多；而在貴州產半夏中僅檢測出鳥苷，肌苷、腺苷、尿苷均未被檢出，這與其余4個產地半夏正品檢測結果出入較大，此數據是否具有代表性，還有待進一步實驗。通過對現階段市場流通半夏偽品采樣進行檢測發現，掌葉半夏所含肌苷、腺苷、尿苷和鳥苷的含有量均較大，甚至比半夏正品的含有量大。目前市場上多用掌葉半夏混為天南星入藥，甚至有多數省份將掌葉半夏看為質量較優的天南星藥材，同時也存在與半夏通用的情況［17-18］，這可能與掌葉半夏中核苷類成分含有量較多有關。有文獻研究報道，水半夏與半夏的藥理作用基本相似，臨床上可局部作為半夏的代替品［19-20］。

3.2 提取方法及色譜條件選擇 本實驗選擇純水、甲醇、乙醇、甲醇-水、乙醇-水等作為提取溶劑，結果顯示純水的提取效率較高。在提取方法的選擇上，考察回流提取法、超聲提取法等，結果超聲提取效率較高。選擇超聲法提取的同時，對影響超聲條件的功率、頻率、提取時間進行考察最后選擇超聲功率500 W，頻率40 kHz，提取45 min 效果最優。

色譜條件的選擇上，分別比較了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-甲酸水等不同流動相對色譜峰的影響，結果乙腈-水分離效果較好。本實驗選擇用色譜柱Agilent ZORBAX SB-AqC18親水柱進行實驗，保證了條件的優化。

本實驗對不同產地的半夏與其偽品中4 種核苷類成分進行含有量測定，建立的方法穩定、高效、快捷，以期有利于在種植、產地初加工、炮制等方面進行質量控制，同時為半夏的藥效及毒性的物質基礎研究提供依據。